Ⅱ型猪圆环病毒ORP2基因的原核表达与初步应用

Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的重要病原．本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORP2为模板，扩增截短的ORP2（tORF2）基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒pGEX-tORP2并转化大肠杆菌BL21（DE3）．经SDS-PAGE及Western blot鉴定，成功表达了谷胱甘肽S转移酶（GST）融合的tORP2，重组蛋白分子量约为45ku，表达量约为菌体总蛋白的20％，重组蛋白具有良好的免疫学活性．用tORP2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）阳性猪血清进行Western blot检测，有4份（20％）血清显示PCV2抗体阳性，说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象．本研究初步证明表达的tORV2重组融合蛋白可以应用于临床检测．     

青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

为表达青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR),构建了TSHR基因的原核表达载体pGEX-4T-1-TSHR,并将其转化入大肠杆菌DH5α中.采用IPTG诱导蛋白表达,并用SDS-PAGE分析表达蛋白.利用抗TSHR多克隆抗体进行Western blot检测.结果表明重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达,融合蛋白的分子大小约为76kDa,Western blot检测说明得到的融合蛋白为TSHR蛋白,成功构建了文昌鱼TSHR基因的原核表达载体.     

猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达

 将甲肝病毒vp1编码基因(aa 24~171)和戊型肝炎病毒ORF2基因(aa 431~615)通过一段编码柔性甘氨酸链(Gly4 Ser Gly4)的基因片断连接,获得编码HAV/HEV融合蛋白基因(AEAg342).将该融合基因插入质粒pBV220,构建表达质粒pBV220-AEAg342.将pBV220-AEAg342转化入大肠杆菌BL21中进行表达,表达量约占菌体总量的20%,经离子交换层析纯化,目的蛋白纯度达90%以上.Western blot证实该蛋白能与甲肝及戊肝患者阳性血清发生特异性反映,为进一步开发双价疫苗和联合诊断试剂奠定了一定基础.     

猪圆环病毒Ⅱ型抗体检测ELISA试剂盒的制备

猪圆环病毒(PCV)两个血清型中只有PCV2为致病性病毒.将ORF2蛋白作为抗原建立区别两型PCV的血清学检测方法.去除N端信号肽的ORF2片段在大肠杆菌中BL21(DE3)中进行了表达.SDS-PAGE凝胶电泳表明在26 k D处有一个明显的表达条带,并且可以和猪圆环病毒阳性血清发生反应,表明重组蛋白表达成功.以表达的ORF2蛋白作为包被原,建立了检测猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法.与商品化试剂盒同时检验78份临床血清,符合率为95%;同时与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒均无交叉反应.     

花生AhAO2基因融合表达、纯化与抗体制备

研究构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2的实验结果显示,重组pPROEX-Hta-AhAO2表达质粒在E.coli BL21中高表达His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,Western blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白的可溶性表达

利用原核表达系统构建猪圆环病毒2型病毒(PCV2)衣壳蛋白.首先构建具有谷胱甘肽转移酶标签的重组质粒p GEX4T1-ORF2,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,表达并纯化得到可溶性的融合蛋白.进一步通过纳米粒度仪及免疫印迹等技术,分别研究了PCV2蛋白的粒径分布以及免疫原性.实验结果表明,BL21-p GEX4T1-ORF2菌株构建成功,能够可溶性地表达猪圆环病毒2型病毒衣壳蛋白,且蛋白具有免疫原性.     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

融合蛋白TAT-p53-MTS的促细胞凋亡作用

本研究首先构建了融合蛋白 TAT-p53-MTS 的原核表达质粒 pET-22b(+)-TAT-p53-MTS,将表达纯化的融合蛋白与p53缺陷型人肺癌细胞NCI-H1299孵育,通过Western blot和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测融合蛋白的细胞穿膜以及与 Bcl-2蛋白的相互作用,并通过流式细胞术检测融合蛋白对 NCI-H1299细胞的促凋亡作用。结果显示,融合TAT和MTS的p53重组蛋白具有更强的细胞穿膜及线粒体定位能力;并且,融合蛋白能够通过与Bcl-2蛋白的结合显著诱导NCI-H 1299细胞的凋亡。     

猪呼吸道冠状病毒核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

以RT—PCR法从猪呼吸道冠状病毒(PRCV)感染的ST细胞中得到核衣壳蛋白(N蛋白)cDNA,并以此为模板利用PCR技术完成了N蛋白的基因扩增．通过双酶切、连接、转化等过程构建了猪PRCVN蛋白基因的重组原核表达质粒,表达产物经SDS—PAGE、Western blot检测被确认为GST融合的N蛋白．表达蛋白与PRCV阳性血清间有良好的免疫结合性．     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

柔嫩艾美耳球虫Serpin基因在293T细胞中的表达

为了检测柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,Serpin)基因(EtSerpin)在真核细胞293T中的表达情况,以Et孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增含完整Serpin开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtSerpin质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtSerpin.该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞,用间接免疫荧光法和Western blot鉴定EtSerpin基因的表达情况,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光,Western blot结果显示出大小约45.5kDa的目的蛋白条带,结果表明构建的EtSerpin可以在293T细胞中获得表达.     

重组诺如病毒P颗粒的表达纯化及免疫原性

通过构建重组质粒并表达纯化目的蛋白,用SDS-PAGE、Western blot和NativePAGE检测蛋白,用Superdex~(TM)200凝胶色谱层析分析目的蛋白的多聚体,用动态光散射以及透射电镜对目的蛋白颗粒进行分析,并通过小鼠免疫,用四免血清进行酶联免疫吸附实验检测蛋白的免疫反应.结果表明:成功构建了质粒pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123,并成功表达目的蛋白;目的蛋白存在3种寡聚体形式,分别为24聚体、12聚体和二聚体;蛋白颗粒约为20nm,并对β淀粉样蛋白有免疫反应.     

重组猪生长激素抗体的制备与纯化

为了获得重组猪生长激素抗体,对重组猪生长激素融合基因的真核表达产物进行免疫印迹(Western blot)检测,将利用DNA重组技术构建的重组质粒pPGH020在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行诱导表达.表达产物经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化的重组猪生长激素融合蛋白.然后以此为抗原免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体,抗体再经硫铵沉淀、透析和亲和层析纯化.Western印迹结果表明,该纯化抗体显示了良好的免疫反应,其灵敏度比兔抗rpGH抗血清提高50倍,为猪生长激素融合基因在真核细胞的表达及功能鉴定奠定了基础.     

IL18-IL2融合基因的克隆及其在大肠埃氏菌(E.coli)中的表达

构建IL-18和IL-2成熟区的融合基因IL18-IL2,并实现其在大肠埃氏菌中的大量表达.抽提经PHA刺激增殖的人淋巴细胞总RNA,RT-PCR法获得IL-18和IL-2基因的成熟区序列,并通过一段Linker相连得到融合基因IL18-IL2;将IL18-IL2克隆至原核表达载体pBV220,并转化至大肠埃氏菌BL21(DE3);阳性克隆经42℃温度诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达情况及正确性.经SDS-PAGE分析,融合基因IL18-IL2在宿主菌中能够表达,其相对表观分子质量约为34.5 kD;Western blot进一步证明重组蛋白正确.实验结果表明,已成功构建了表达人IL18-IL2的菌株,为进一步研究融合蛋白IL18-IL2体内外抗肿瘤活性提供了基础.     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.     

靶向树突状细胞的呼吸道合胞病毒F重组蛋白的构建与体外活性分析

分析以人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)融合糖蛋白(fusion glycoprotein,F)为抗原靶向DEC205/CD205受体策略对重组F蛋白表达及活性的影响.F蛋白是RSV的重要中和抗原,克隆RSV F蛋白胞外区的编码基因至可识别鼠树突状细胞(Dendritic cells,DCs)DEC205受体的单链抗体(single chain antibody of anti-DEC205,scDEC)的C端,构建可表达重组F蛋白(scDECF)的质粒pVAX1/scDECF,Western blot方法检测scDECF的表达,免疫荧光法和流式细胞术检测表达的scDECF与DEC205受体的结合活性.经Western blot证实在pVAX1/scDECF转染的293T细胞成功表达了scDECF.将所获得的细胞培养上清与表达鼠DEC205受体的细胞CHOmDEC205孵育,用免疫荧光和流式细胞术证实:与作为对照的重组F蛋白scISOF相比,所获得的scDECF与CHOmDEC205细胞呈现明显的结合.本研究成功表达了重组蛋白scDECF,且所获得的重组蛋白scDECF具有与表达DEC205受体的细胞特异性结合的活性.     

细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体融合蛋白的构建及表达

用RT-PCR方法从人胎肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因,并用酶切连接方法将其与抗人AFP嵌合抗体拼接,连接到质粒pVITRO上,构建真核表达载体.将重组质粒转染CHO细胞,以RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测融合蛋白的表达.结果显示稳定转染细胞株有约150kDa的融合蛋白表达.