ICBP90介导PI3K/AKT通路阻断剂LY294002抑制Jurkat T细胞增殖

目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路特异性抑制剂LY294002在JurkatT细胞增殖中的作用.方法:以急性T细胞白血病胞(Jurkat T 细胞)为模型,PD98059和阿霉素为阳性对照,在倒置显微镜下观察LY294002对Jurkat T细胞的集落形成的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测LY294002处理后Jurkat T细胞的增殖,流式细胞术检测LY294002处理后Jurkat T细胞周期的变化,Western blotting方法检测Jurkat T细胞中ICBP90蛋白的表达以确定其与LY294002抑制Jurkat T细胞增殖的关系.结果:LY294002能够显著抑制Jurkat T细胞的集落形成和增殖,使Jurkat T细胞停滞于G2/M 期,导致Jurkat T细胞ICBP90蛋白的表达显著降低,LY294002与阿霉素联合用药可产生一定的协同效应. 结论:LY294002通过下调Jur-katT细胞ICBP90蛋白的表达,抑制Jurkat T细胞增殖.     

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy, HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现，有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统，为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统，本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒，筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子，筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后，我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region, LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)的AAV6递送载体系统，感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya, T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除，流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-...     

HIV-1 pol基因人工miRNA的构建和功能分析

以miR-155为基础骨架,根据HIV-1pol基因序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,构建4个人工miR-pol,并对其进行功能分析.qPCR结果显示,4个人工miR-pol对pol基因都具有一定的沉默效果,其中miR-pol-4的沉默效率最高,达76％.进一步的实验证实miR-pol-4不会影响被转染细胞的活性,也不会对细胞干扰素的表达产生影响.此外,HIV-1假病毒实验显示,miR-pol-4对HIV-1的复制具有良好的抑制作用.因此,所获得的miR-pol-4将可为进一步的抗HIV-1感染研究提供基础.     

E6相关蛋白对前列腺癌细胞增殖与侵袭的作用

目的建立稳定表达E6-AP的前列腺癌细胞系,通过对E6-AP表达调控的研究,探讨E6相关蛋白对前列腺癌细胞增殖与侵袭作用.方法以人前列腺癌细胞株(LNCa P)为基础,将调控质粒pRev Tet-offin和E6-AP表达质粒p GEM-E6-AP转染至LNCa P细胞,建立既能表达E6-AP蛋白又能受DOX调控的LNCa P/E6-AP细胞系.Western bloting检测LNCa P/E6-AP细胞E6-AP蛋白表达及其受DOX调控情况; MTT方法检测细胞增殖及受LY294002抑制情况;基质胶侵袭实验检测细胞浸润迁移能力.结果 LNCa P/E6-AP细胞E6-AP表达量明显高于LNCa P细胞,且可受DOX负向调控;实验组LNCa P/E6-AP细胞的增殖能力明显高于对照组LNCa P细胞,且两组细胞增殖能力均受PI3K抑制剂LY294002的抑制;实验组LNCa P/E6-AP细胞的侵袭能力明显高于对照组LNCa P细胞.结论 E6-AP可以促进前列腺癌细胞的增殖,并增加其侵袭能力; DOX可以调控E6-AP的表达;PI3K抑制剂LY294002可有效抑制前列腺癌细胞的增殖能力.     

CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

清开灵注射液体外抑制HIV-1作用

目的:研究清开灵注射液(QKL)体外抑制HIV-1的作用.方法:用MTT比色法检测QKL对H9/HIV-1ⅢB细胞(慢性感染HIV-1ⅢB的H9细胞)和MT-2细胞的毒性;采用荧光染料Calcein-AM标记的H9/HIV-1ⅢB细胞和系列稀释的QKL作用后.与MT-2细胞混合培养,2 h后在荧光下计数融合细胞数目,评价QKL对两种细胞早期融合的影响;用MTT法检测QKL对HIV-1ⅢB急性感染的MT-2细胞的保护作用;用HIVp24抗原试剂盒检测HIV-1ⅢB感染的MT-2细胞的培养上清p24抗原的含量,分析QKL对HIV-1复制的影响.结果:QKL对H9/HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞的CC50分别为1/50.76和1/36.97;抑制H9/HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞早期融合作用的EC50=1/235.29,SI=6.36;对HIV-1ⅢB感染的MT-2细胞保护作用的EC50=1/144.93,SI=3.92;抑制p24抗原产生作用的EC50=1/175.44,SI=4.75.结论:QKL体外有抗HIV-1活性,作用机制可能是多靶点的,可抑制病毒进入细胞和胞内复制.     

核不均一性核糖核蛋白H2（hnRNPH2）对单纯疱疹病毒（HSVI）复制影响

本文研究了单纯疱疹病毒（HSVI）在感染与复制过程中影响宿主细胞RNA转录，蛋白表达，进而为病毒的潜伏和持续感染创造必要条件．采用基于2-DE分析，人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2（heterogeneous nutlear ribonucleoprotein H2，hnRNPH2）在感染HSVI前后存在表达差异，构建pcDNA-hnRNPH2真核表达载体及hnRNPH2稳定转染的293T细胞系的方法，研究在核不均一性核糖核蛋白H2（hnRNPH2）稳定过表达后对HSVI病毒复制周期的影响．结果表明，病毒滴度和生长曲线显示，hnRNPH2可以显著影响病毒复制周期．过表达hnRNPh2的细胞系与对照相比，其病毒滴度明显下降，hnRNPH2在HSVI病毒复制中起到比较明显的抑制作用，其作用机理还有待进一步研究．     

HIV-1感染与树突状细胞相互作用的研究进展(综述)

树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前所知的机体内功能最强的抗原呈递细胞，在免疫应答中发挥重要作用。在AIDS发病机制中有关人类免疫缺陷病毒(HIV)与宿主细胞之间的作用已经有很多报道，但对树突状细胞与HIV感染之间的作用了解较少。近年来的研究发现HIV-1能诱导树突状细胞分化，改编细胞基因表达，上调细胞因子和趋化因子的产生活化T细胞，而不同的DC亚群表达不同的甘露糖C-型凝集素受体(MCLRs)结合HIVgp120，从而促进病毒感染复制和扩散。     

人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化

人乳头瘤病毒假病毒可广泛应用于中和抗体鉴定和疫苗免疫性评估等研究.本研究对多质粒共转染293FT细胞生产HPV假病毒的方法进行了深入优化,结果显示不同的HPV结构蛋白表达质粒转染比例对于假病毒生产效率有显著的影响,HPV主要结构蛋白L1的表达水平是影响生产效率的主要因素,L2表达质粒的用量过高或过低均不利于假病毒的生产,而报告质粒的用量对假病毒生产效率的影响相对较小.综合比较显示,在该体系中L1和L2表达质粒和报告质粒以合适比例(如1:1/10:1/2)进行共转染可获得更为理想的生产效率.本研究同时也在293FT细胞中对磷酸钙转染方法进行了优化,通过磷酸钙与质粒用量的交叉配比试验获得了较优的转染条件.通过优化,建立了更为高效的HPV假病毒大量制备方法,在HPV16、HPV18、HPV6、HPV11假病毒生产中的应用结果显示较原方法可显著提高生产效率.本研究为HPV假病毒中和实验的规模化应用提供了有利条件.     

超抗原SEA体外对Jurkat T淋巴细胞增殖活性与表面超微结构的影响

目的:通过显微形态观察和功能检测分析超抗原(SEA)对Jurkat T淋巴细胞的影响.方法:应用CCK-8法,原子力显微镜(AFM)体外检测Jurkat T淋巴细胞增殖活性、及其细胞膜超微结构的改变.结果:与对照组比较,不同浓度的SEA随着作用时间的增加,细胞膜超微结构与Ra值明显发生改变.Jurkat T淋巴细胞经过质量浓度为0.1-100 mg/L SEA,作用48 h期间,Jurkat T细胞的表面超微结构(平均粗糙度,Ra)和增殖活性(A值)变化非常明显.其中,质量浓度10 mg/L SEA作用24 h,Jurkat T淋巴细胞表面结构变化最明显,而细胞增殖活性在48 h达最强.结论:SEA作为超抗原作用于Jurkat T淋巴细胞后,Jurkat T淋巴细胞的活化表现出表面形态结构改变先于代谢水平的改变,较后者更灵敏.     

葫芦素E对人外周血单个核细胞体外活化及细胞因子表达的影响

目的:分析葫芦素E(Cuc E)对二丁酸佛波醇酯(PDB)和离子霉素(Ion)刺激的人外周血单个核细胞(PBMC)活化及促炎因子表达的影响,探讨其潜在的抗炎效应及作用机制.方法:利用流式细胞术分析人外周血PBMC活化抗原CD69和CD25表达,用流式微球陈列检测白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)表达的变化.结果:Cuc E能明显抑制PDB和Ion刺激引起的CD3+T细胞早期活化标志分子CD69和中期活化分子CD25的表达;同时,Cuc E以剂量依赖方式抑制PDB和Ion诱导的IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达.结论:Cuc E对人外周血CD3+T细胞的活化具有明显抑制作用,同时减少炎症相关细胞因子的表达,提示其通过对适应性免疫的调控发挥抗炎效应.     

人乳头瘤病毒HPV16E6的表达促进角质生成细胞凋亡的发生

为探讨HPV16早期基因E6的表达对角质生成细胞NIKS凋亡表型的影响及可能的机制,经培养稳定表达HPV16E6的角质生成细胞NIKS;使用不同的DNA损伤剂处理转染后细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况;建立表达HPV16E6突变体Y54D及F2V的p53降解缺陷型NIKS细胞系并用DNA损伤剂处理,流式细胞术检测凋亡情况.研究显示,流式细胞术结果显示稳定表达E6的细胞系在足叶乙甙、丝裂霉素及紫衫醇处理后发生明显的细胞凋亡;表达Y54D或F2V的NIKS细胞经DNA损伤剂处理后凋亡明显低于正常E6表达细胞.研究表明,人乳头瘤病毒E6的表达能够促进角质生成细胞凋亡的发生,这种促凋亡作用与细胞内p53的表达相关.     

放线菌酮体外强烈抑制小鼠活化T淋巴细胞CD69表达

目的 :利用淋巴细胞的早期活化标记物CD6 9的表达 ,探讨放线菌酮 (CHX)对T淋巴细胞体外活化的影响 ,以进一步揭示CHX对免疫系统的影响 .方法 :分离小鼠淋巴结细胞 ,与CHX预孵 1h ,加入多克隆刺激剂继续培养 ,总计培养 2 4h后收获细胞 ,进行双色免疫荧光标记 ,以流式细胞术对T细胞的CD6 9分子表达情况进行分析 .结果 :在CHX(终浓度 10 μmol/L)作用下 ,ConA和PDB活化的T细胞CD6 9表达百分率依次为 12 33%± 4 75 %、13 0 7%± 11 0 5 %,与对照组比较均有显著差异 (P <0 0 1) .结论 :CHX(10 μmol/L)对ConA、PDB活化的T淋巴细胞均显示了强烈的抑制效应 .     

滤泡树状突细胞在HIV感染中的作用

滤泡树状突细胞是抗原提呈细胞[1]，它提呈抗原给B细胞和活化的T细胞起动免疫应答。HIV是引起艾滋病的病原体，它可以侵犯T细胞，造成细胞免疫功能极度低下产生艾滋病。滤泡树状突细胞可以提呈HIV-抗HIV复合物给活化的T细胞，使T细胞感染，机体发病。     

γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Jurkat T细胞增殖

目的:探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT在体外对人T淋巴细胞白血病Jurkat T细胞株增殖的抑制作用及其某些机制.方法:通过倒置显微镜和MTT法检测DAPT对Jurkat T细胞聚集的影响和对其增殖的抑制作用;利用碘化丙锭染色结合流式细胞术检测DAPT对Jurkat T细胞周期的影响;藉免疫印迹法检测DAPT对Jurkat T细胞周期蛋白ICBP90表达的影响.结果:DAPT能显著影响Jurkat T细胞的聚集,抑制Jurkat T细胞的增殖,使其细胞周期停滞于S期,且周期蛋白ICBP90的表达下调.结论:γ-分泌酶抑制剂DAPT能够抑制Jurkat T细胞的增殖和细胞周期的进行,其抑制作用可能与ICBP90蛋白表达的下调有关.     

Cyclin E分子siRNA慢病毒载体的构建及其对骨肉瘤细胞系sosp9607的影响

设计筛选针对人cyclin E分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对骨肉瘤细胞系Sosp9607胞内cyclin E分子表达水平的影响.首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与cyclin E分子真核表达载体共同转染293T细胞.挑选出最有效抑制cyclin E表达的序列,应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因cyclin E的siRNA慢病毒载体pLKO-CE.使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收获病毒上清,感染Sosp9607细胞系,对病毒感染后抑制cyclinE表达的效果进行检测.结果在4条针对cyclin E分子设计的siRNA序列中,siRNA-464最为有效的抑制了外源性cyclin E分子的表达;带有该序列的慢病毒载体pLKO-CE可以完全抑制Sosp9607细胞中天然分子的表达,引起Sosp9607细胞生物学行为的改变:G1期细胞增多,S期减少,细胞增殖受抑制.说明应用基因工程技术成功构建了针对cyclin E分子的RNA干扰慢病毒载体,可有效抑制骨肉瘤细胞cyclin E的表达,使肿瘤细胞增殖减缓,为深入研究针对cyclin E的基因治疗方案的临床前实验研究提供了实验证据和理论依据.     

SMYD3对氯化钴诱导T47D乳腺癌细胞缺氧的影响分析

为了探究组蛋白甲基化酶SMYD3是否会对氯化钴(CoCl_2)诱导乳腺癌细胞缺氧损伤作用产生影响,采用MTT法和流式细胞术检测不同浓度的CoCl_2(0、50、100、200、400,μmol/L)给药24,h以及联合转染过表达质粒使SMYD3过表达后对T47D细胞的增殖及细胞周期的影响;实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测其对SMYD3转录表达的影响情况.MTT和流式细胞术结果显示:CoCl_2可剂量依赖性地对T47D乳腺癌细胞的增殖产生抑制作用(P0.01),并诱导产生G0/G1期细胞周期阻滞(P0.05).CoCl_2可以抑制SMYD3的转录(P0.01).利用siRNA抑制内源性SMYD3表达后同样可诱导细胞发生G0/G1期阻滞(P0.05),而转染外源质粒使SMYD3过表达则可明显拮抗CoCl_2所诱导的G0/G1期阻滞及对细胞的杀伤作用.CoCl_2对T47D细胞的周期调控作用可能与抑制SMYD3的表达有关,SMYD3的过表达可提升肿瘤细胞在缺氧环境下的存活能力.     

HIV-1病毒样颗粒真核表达系统的建立

目的 利用哺乳动物细胞表达HIV-1病毒样颗粒,为HIV-1病毒的生物学研究和进一步设计HIV-1中和优势表位预防性疫苗奠定基础.方法 以293T细胞作为宿主细胞,利用磷酸钙沉淀法将带有HIV-1病毒被膜蛋白gp160基因的pcDNA3.1/BaL gp160真核表达载体和带有HIV-1核心蛋白(gag)的pVRC3900真核表达载体共转染至293T细胞中,收集培养上清,经蔗糖不连续梯度离心,收集病毒样颗粒,经磷钨酸负染,透射电镜观察结果 .结果 以磷酸钙沉淀DNA转移技术,EGFP真核表达质粒为靶基因,293T细胞为宿主细胞,最佳转染效率达30%以上;将peDt NA3.1/BaL gp160(env)和pVRC3900(gag)真核表达质粒共转染,宿主细胞成功表达目的 蛋白,转染细胞培养上清经蔗糖密度梯度离心,电镜观察可见自行装配的HIV病毒样颗粒.结论 在真核细胞中表达HIV-1病毒样颗粒.     

抗人PD-1高亲和力抗血清的制备及其在PD-1免疫印迹分析中的应用

利用纯化的可溶性人PD-1胞外域(sPD-1)蛋白为免疫原免疫小鼠,获得抗血清.免疫印迹显示该抗血清与原核表达的sPD-1有特异性反应,但与某些菌体蛋白存在交叉反应.经菌体蛋白吸附法处理后,交叉反应明显减弱.以商业化抗人PD-1抗体和小鼠sPD-1抗血清分析经亲和层析富集的活化的Jurkat T细胞表达的PD-1,只有自制的抗血清鉴定到特异反应条带,其表观分子质量为49 ku.     

nPKC-PKD3信号传导途径介导Prostratin活化HIV-1转录

采用HIV-LTR-Luc稳定细胞株分析其荧光素酶活性,研究Prostratin活化潜伏的艾滋病毒的分子机制.实验结果表明:随药物浓度升高和处理时间延长,Prostratin能明显激活HIV-1转录.采用PKC抑制剂拮抗nPKC活性,能有效阻断Prostratin对HIV-1的激活;反之,过表达nPKC能激活HIV-1转录.最后,敲低PKD3高效拮抗Prostratin激活的HIV-1转录.因此,nPKC-PKD3信号途径参与Prostratin活化HIV-1转录,从而激活潜伏的艾滋病毒.本研究为开发新的抗艾滋病药物筛选模型提供了可靠的理论依据.