CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用

通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZ siRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Western blot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

干涉UBXN1慢病毒颗粒制备及稳定细胞系的建立

构建并鉴定UBXN1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统建立稳定干涉细胞系并进一步研究UBXN1的功能。将携带不同特异性干涉序列的DNA片段插入PLKO.1载体中构建慢病毒表达载体,并制备慢病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染U2OS细胞,建立稳定干涉细胞系,应用real-time PCR和western blot技术分别检测U2OS细胞中UBXN1 mRNA和蛋白质水平的表达差异。重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,western blot检测证实设计的五条shRNA干扰序列有效的敲低U2OS细胞中内源性UBXN1的表达。成功制备UBXN1的慢病毒干涉颗粒,并建立UBXN1稳定下调的U2OS细胞系。     

慢病毒介导的HPV16-E7基因RNAi细胞模型的建立

 建立HPV16-E7基因的RNAi细胞模型,可为进一步研究HPV16-E7蛋白作用及致癌机制提供物质前提。选择HPV16-E7基因特异的siRNA片段,构建慢病毒siRNA重组表达载体,经293FT病毒包装细胞转染产生重组病毒,并以此感染HPV16阳性SiHa宫颈癌细胞、抗菌素筛选和分子生物学鉴定,建立了稳定表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型。该细胞模型,对目标基因（E7）表达的抑制效率,也以蛋白免疫印迹和RT-PCR确证。由此得出,利用慢病毒载体和HPV16-E7基因特异的siRNA片段,可以建立一种稳定、有效和可行的RNAi细胞模型,为进一步研究E7蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

靶向hTERT的shRNA腺病毒载体的构建及其对MCF-7细胞hTERT表达的影响

设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT,构建siRNA表达质粒PgenesilhTERT;随后将shRNA表达框克隆到入门载体pENTRTM1A,构建重组质粒pENTR/U6-hTERT-polyA;使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL-DEST,得到重组腺病毒质粒pAd/U6 –TERT-polyA;线性化的重组腺病毒质粒在HEK 293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒rAd-hTERT.同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照rAd-HK,空病毒对照rAd-blank和只含EGFP的rAd -EGFP.四种病毒经酶切、电泳分析表明插入序列正确,腺病毒载体构建成功.Western blotting测定转染后各组hTERT蛋白的表达情况,证实转染rAd-hTERT 48 h后,hTERT的表达明显被抑制.实验表明基于Gateway技术的腺病毒介导的shRNA载体构建成功,rAd-hTERT可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT基因的表达.本研究为针对端粒酶的基因治疗奠定了实验基础.     

敲低EYA3基因抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长

为了探讨人眼缺失基因(EYA3)在人视网膜母细胞瘤发生发展中的生物学作用,构建了EYA3小干扰RNA (siRNA)的真核表达载体,并验证敲低效果和观察其对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响.根据人EYA3的cDNA序列,将设计含有小发卡结构的寡核苷酸序列克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染HEK293T细胞中,通过实时定量RT-PCR及Western印迹检测EYA3基因的表达水平;重组质粒稳定转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞并利用生长曲线检测EYA3对其生长的影响.结果表明:构建的siRNA能够抑制EYA3基因的表达,生长曲线验证EYA3 siRNA基因能抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长.最后结论是EYA3 siRNA能够抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在视网膜母细胞瘤中的功能奠定了基础.     

电压门控性钾离子通道对人骨肉瘤细胞增殖的影响

研究钾离子通道在人骨肉瘤细胞的表达及通道抑制剂对人骨肉瘤细胞系增殖的影响.通过RT-PCR对三株人骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2和SOSP-9607中相关钾离子通道,包括kv1.1, kv1.3, kv1.5, kv2.1, kv3.3/3.4, kv4.1, kv5.1, kv9.3, herg, heag 和kcnq1的基因表达进行检测;用非特异性的电压门控性钾离子通道抑制剂4-AP(4-aminopyridine,4-氨基吡啶)和氯化铯(CsCl),特异性的HERG、HEAG 、和KCa通道抑制剂E-4031、丙咪嗪(imipramine) 和TEA (tetraethylammonium,四乙铵)通过MTT法检测抑制剂对三株人骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2和SOSP-9607细胞增殖的影响.通过RT-PCR发现kv1.3, kv1.5, kv2.1, kv3.3/3.4, kv4.1, kv9.3, herg和heag通道基因在三株骨肉瘤细胞系中均有表达,而kv5.1通道基因只在MG63细胞中表达,kcnq1通道基因只在SOSP-607和MG63细胞中表达.MTT法检测发现:E-4031, imipramine 和TEA 对三株骨肉瘤细胞的增殖没有明显的影响,而4-AP药物浓度在3 mol和5 mol时对细胞增殖影响明显.CSCL药物浓度在5 mol时对细胞增殖也有影响,但影响程度较4-AP小.提示钾离子通道在RNA水平广泛地表达于实验的三株人骨肉瘤细胞中,但只有电压门控性钾离子通道参与细胞增殖过程的调节.     

原代小鼠卵巢上皮细胞TP53基因敲除及其生物学特征变化

目的 利用CRISPR/Cas9慢病毒载体系统建立小鼠原代卵巢上皮细胞TP53基因稳定敲除细胞系,分析细胞增殖、细胞周期、克隆形成以及细胞转移侵袭能力的变化。方法 构建LentiCRISPRv2-sgRNA TP53基因敲除质粒,用293FT细胞进行慢病毒包装,转导小鼠原代卵巢上皮细胞,嘌呤霉素筛选出稳定敲除细胞系,进行PCR、蛋白免疫印迹以及免疫荧光鉴定。细胞增殖、细胞周期变化、克隆形成、细胞迁移侵袭能力分别用MTT、流式细胞分析、单层培养以及Transwell小室进行测定。结果 TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮细胞中P53表达缺失;TP53敲除引起细胞迅速增殖,DNA合成加速,克隆形成以及迁移侵袭能力增强。结论 获得了原代小鼠卵巢上皮细胞TP53基因稳定敲除细胞系,细胞生物学特征明显改变。