宫颈癌中CALCA基因甲基化与HPV16-E7致癌蛋白表达的依存关系

 选择HPV16 阳性宫颈癌细胞和RNAi 技术,研究CALCA 基因甲基化与HPV16-E7 致癌蛋白表达的依存关系。构建慢病毒siRNA 重组表达载体,建立稳定表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型。以SiHa 细胞和RNAi 细胞模型的基因组DNA 为对象,选择CALCA 基因启动子区富含CpG 岛屿的目标片段,使用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）筛查分析,研究RNAi 抑制HPV16-E 7 表达后,CALCA 基因甲基化状态的可逆性程度。选出CALCA 基因启动子区富含CpG 位点的目标片段,其大小为365 bp,含有19 个CpG 岛屿,发现其中13 个CpG 位点的胞嘧啶在SiHa 细胞基因组DNA 中发生了甲基化（13/19）,而在表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型中,所有CpG 位点的甲基化已发生逆转（0/19 位点）。本研究从细胞水平证明了宫颈癌细胞内的CALCA 基因启动子高甲基化对HPV16-E7 致癌蛋白表达有依赖性,为进一步研究E7 蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

HPV16、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体的构建

目的:构建一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体.方法:PCR扩增HPV16型、18型E6、E7基因,克隆到pSC-A载体中,通过定点突变方法,分别构建成含E6/E7融合基因的质粒,即pSC-A.HPV16 E6/E7和pSC-A-HPV18 mE6/E7,并将二者连接成载体pSC-A-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E(pSC-T,HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7:T),最后以痘苗病毒表达载体pJ38为转移载体,构建质粒pJ38-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pJ38-T),对所有重组质粒进行酶切鉴定和测序分析.结果:E6/E7融合基因成功克隆到pJ38上.结论:成功构建表达HPV E6/E7融合基因重组痘苗病毒载体,为研制宫颈癌治疗性疫苗奠定基础.     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用

通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZ siRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Western blot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据.     

荧光定量PCR法在人类宫颈癌RNA干扰中的应用

研究荧光定量PCR法在RNA干扰（RNAi）技术抑制宫颈癌Caski细胞人乳头瘤病毒16型E6基因（HPV16E6）的应用情况,并与传统使用的灰度值分析法进行比较。构建shRNA重组质粒干扰载体转染至Caski细胞中。通过荧光定量PCR法和灰度值分析法检测干扰后细胞HPV16E6基因的mRNA及蛋白质表达水平。实验表明HPV16E6基因mRNA及蛋白质的表达量都有明显降低,与阴性对照空白质粒组相比有显著差异（P〈0．01）;RNAi对宫颈癌Caski细胞中HPV16E6基因的表达具有较高的抑制率;荧光定量PCR法较之传统的灰度值分析法更为准确。     

干涉UBXN1慢病毒颗粒制备及稳定细胞系的建立

构建并鉴定UBXN1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统建立稳定干涉细胞系并进一步研究UBXN1的功能。将携带不同特异性干涉序列的DNA片段插入PLKO.1载体中构建慢病毒表达载体,并制备慢病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染U2OS细胞,建立稳定干涉细胞系,应用real-time PCR和western blot技术分别检测U2OS细胞中UBXN1 mRNA和蛋白质水平的表达差异。重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,western blot检测证实设计的五条shRNA干扰序列有效的敲低U2OS细胞中内源性UBXN1的表达。成功制备UBXN1的慢病毒干涉颗粒,并建立UBXN1稳定下调的U2OS细胞系。     

慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定

研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)及嘌呤霉素(Puromycin)抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。     

CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体，为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响，设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中，构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA；建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明，已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

IFI16基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为了构建可在人喉癌细胞中稳定表达 IFI16基因短发夹RNA（shRNA）的表达载体,设计合成的IFI16基因shRNA片段,连接到经BamH I和 EcoR I双酶切的pGreenPuroTM shRNA表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取几个抗性菌落,用PCR技术初步进行鉴定,经PCR初步鉴定为重组质粒的一个重组子DNA用测序进一步鉴定,测序结果显示成功构建了 IFI16基因shRNA的表达载体pGreenPuro-IFI16 shRNA 。     

MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定

摘要:构建人mir-218-2, pre-miRNA慢病毒表达载体,为研究miR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-mir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体,PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内miR-218表达。结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高miR-218的表达。说明本实验成功构建了hsa-mir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高miR-218的表达。为进一步研究miR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础。     

携人源TPA基因的慢病毒表达质粒的构建与鉴定

利用PCR扩增人源TPA基因,再用酶切-连接的方法将目的片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-PGK-eGFP中,最后用测序、酶切和在293细胞中瞬时表达的方法进行了鉴定.结果显示：含人源TPA基因的pL-PGK-TPA-eGFP慢病毒表达载体构建成功,为进一步利用转基因技术更加安全高效地生产TPA,治疗血栓类疾病打下基础.     

随机局部凸模上L0-值函数次微分和近似次微分性质

 研究了随机凸分析中的次微分与近似次微分问题。在层次结构分析以及最近建立的随机局部凸模上的分离定理基础上,本文得到了关于随机局部凸模上L⁰值函数的次微分和近似次微分的一些良好基本性质。首先由随机局部凸模上点与集合的分离定理,证明了：对于具有可数连结性质的随机局部凸模上真的、T_c-下半连续的、L⁰(F)-凸函数,它的近似次微分非空;再者,由随机局部凸模上两个集合的分离定理,证明了对于具有可数连结性质的随机局部凸模上两个真的、T_c-下半连续的、L⁰(F)-凸函数,及其次微分公式。其中,L⁰(F)表示定义在概率空间上的广义实值随机变量等价类全体形成的集合。本文推广了经典凸分析中的相应结果。     

靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装验证

为了解决靶向TTF-1的siRNA导入肺腺癌细胞的问题,设计了3条靶向NCI-H1975细胞TTF-1基因的siRNA,并将其分别构建到腺相关病毒上.在293细胞中装配病毒,收获病毒原初液后进行超滤浓缩、层析柱纯化,测定病毒滴度.重组病毒感染肺腺癌细胞系NCI-H1975,通过Western-Blot实验检测siRNA效果,利用凋亡实验验证细胞生物学效应.Western-Blot实验测得siRNA有较好的干扰效果,凋亡实验测得肺腺癌细胞NCI-H1975产生了凋亡,从而证明具有感染性的靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装成功.     

PIK3CA基因突变及PTEN表达与西妥昔单抗疗效的关系

 对西妥昔单抗治疗的KRAS野生型结直肠癌患者进行疗效评估及随访,收集每例患者的癌组织标本及临床病理资料,检测每例患者BRAF、PIK3CA基因的突变情况,采用免疫组织化学染色检测PTEN在癌及癌旁组织中的表达情况.结果显示,KRAS、BRAF及PIK3CA基因均为野生型的患者对单抗治疗的反应率为62.5%(CR+PR),而存在BRAF及PIK3CA突变患者的反应率分别为0,28.6%,证实BRAF及PIK3CA的突变可显著影响西妥昔单抗(C225)的疗效.PTEN主要表达在细胞核内,在癌组织中表达降低或缺失,在正常组织中表达正常,并且PTEN的表达与C225的疗效密切相关,PTEN表达阳性及阴性患者的反应率(CR+PR)分别为42.9%,36.4%(P＜0.05).BRAF、PIK3CA的突变和PTEN的表达缺失可以显著影响C225的疗效.     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

S8联合小分子化合物Z18的抗肿瘤效应研究

 为了探讨S8联合小分子化合物Z18的抗肿瘤效应,本研究通过联合用药方式处理HeLa细胞后,采用台盼蓝染色和流式细胞仪对细胞死亡率和死亡方式进行检测。电镜实验证实Z18诱导细胞自噬,并利用Western Blotting检测联合用药后LC3-II的变化和使用转染了GFP-LC3或mRFP-EGFP-LC3的HeLa细胞检测联合用药对细胞自噬和自噬流的影响。最后通过ATG5 siRNA和CQ抑制自噬和自噬流,观察联合用药对细胞的自噬和死亡的变化,进一步研究S8对Z18的抗肿瘤作用的影响。结果显示,S8联合用药后,细胞死亡率显著升高(P<0.05),死亡方式主要以坏死为主。S8明显地促进了Z18对HeLa细胞的毒性,其促进作用具有剂量依赖性。但联合用药并未降低Z18引起的自噬空泡集聚,LC3-II蛋白表达也未发生变化。抑制自噬后,并未影响联合用药促进细胞死亡的结果。因此,Z18在联合使用S8的情况下,细胞自噬水平没有发生明显变化,而细胞死亡比例明显升高,自噬并不影响联合用药诱导的细胞死亡。S8可能通过调节细胞坏死的其他途径进而促进细胞对Z18的敏感性,并进一步使细胞发生坏死。