Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,设计合成Egr-1基因shRNA片段,连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuro~(TM)shRNA真核表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养,经菌液PCR法初步鉴定为pGreenPuro-Egr-1shRNA重组子的重组子DNA,用测序法进一步鉴定,结果显示成功构建了Egr-1基因shRNA的反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1shRNA.     

pEGFP-IFI16表达载体构建及其表达对Hep-2细胞增殖的影响

RT-PCR扩增的IFI16基因连接到pUCm-T载体并测序鉴定,经测序正确的IFI16基因再连接到pEGFP-C1载体构建pEGFP-IFI16重组质粒,重组质粒pEGFP-IFI16转染Hep-2细胞后用荧光显微镜及半定量RT-PCR分析其表达情况,并用流式细胞仪测定细胞生长曲线分析其表达对Hep-2细胞增殖的影响.结果显示pEGFP-IFI16重组质粒构建正确,转染Hep-2细胞后荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,半定量RT-PCR结果显示转染后Hep-2细胞IFI16基因条带亮度明显升高,细胞生长曲线测定结果显示转染后Hep-2细胞从第二天起其增殖速度变慢、至第三天时其增殖速度明显慢于对照细胞的增殖速度.说明成功构建了能在Hep-2细胞中表达EGFP-IFI16融合蛋白的pEGFP-IFI16重组质粒,pEGFP-IFI16重组质粒体表达能抑制Hep-2细胞的增殖.     

IFI27L2慢病毒稳定干涉细胞系的建立以及其在炎症小体激活中的功能鉴定

通过构建IFI27L2分子的慢病毒干涉表达载体,建立IFI27L2表达下调的THP1、U937稳定细胞系。将携带特异性干涉IFI27L2的DNA片段克隆插入p LKO.1载体中,并制备携带不同干涉序列的慢病毒颗粒。将获得的慢病毒颗粒感染THP1、U937细胞,建立稳定干涉细胞系,经Real-time PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白质水平检测THP1、U937细胞中内源IFI27L2的干涉效果。构建的重组质粒经酶切鉴定shRNA正确插入慢病毒载体,测序鉴定序列正确;并有干涉效果。成功制备了稳定干涉IFI27L2的慢病毒颗粒,建立IFI27L2稳定下调的THP1、U937两种细胞系;并初步证明稳定干涉IFI27L2能够抑制NLRP3炎症小体的激活。     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

烟草反义Mlo基因表达载体的构建

获得烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo,为进行烟草遗传转化,获得该基因表达的缺陷型植株打下基础.从烟草叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到Mlo基因的c DNA,以此为模板设计反义引物,通过PCR扩增出反义Mlo基因,将此反义Mlo基因与T载体连接,测序正确后再将此反义片段与植物表达载体pBI 121连接,构建烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo.经Kan选择筛选出反义重组菌落,碱裂解法小量提取质粒后,用Xba I和Bam HI双酶切后再进行电泳鉴定.结果表明,目的基因已与植物表达载体pBI 121连接成功.成功构建了烟草反义Mlo基因表达载体pBI 121-Mlo.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

产毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建

利用PCR技术从原始菌种中扩增得到K99和LTB基因,将K99和LTB基因连接起来,构建了LTB-K99融合基因.融合基因克隆到pBS-T载体上,转化大肠杆菌top10,经Bam HI和Xho I双酶切鉴定重组质粒.测序分析结果表明,该融合基因有正确的阅读框,为以后转入表达载体的构建奠定了基础.     

干酪乳杆菌同源整合载体的构建与鉴定

构建乳酸菌同源重组载体,以实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。PCR扩增lacZ基因表达盒lacZ-cassette,和upp基因表达盒upp-cassette,SOE-PCR扩增lacZ-P-upp,产物回收后连接到pORI28载体中,构建载体pORZP;根据干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393全基因组中lai基因序列设计引物,PCR扩增lai基因两端同源重组臂lai-up和lai-down基因序列,产物经回收后,连接至pORZP载体中,得同源重组载体pORZPlai。双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pORZP-lai,为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。     

pegfp/glur6重组表达载体的构建

目的：构建pegfp/glur6重组表达载体。方法：用基因重组技术构建pegfp/glur6重组表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜检测。结果：经酶切和PCR鉴定重组质粒pegfp/glur6重组表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜显示融合蛋白在细胞中表达。结论：基因重组技术成功构建pegfp/glur6重组体。     

NS特异性干扰载体pGenesil-1-NS的构建及鉴定

目的核干细胞因子(nucleostemin,NS)是维持干细胞和癌细胞增殖所必需的蛋白质,可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点.本文旨在构建靶向NS干扰载体p Genesil-1-NS,为后续实验奠定基础.方法基于已发布的NS mRNA序列(NM_206825),选取5'-AAGCCTA GGAAAGACCCAGG-3'(397-416)作为候选靶序列,按shRNA载体设计原则,设计合成两条互补DNA链,退火后插入载体,并以酶切和测序鉴定重组转化子.结果经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体.结论成功构建NS特异性干扰载体p Genesil-1-NS,可用于NS在肿瘤中的功能研究.     

AFP基因shRNA表达质粒稳定转染肝癌细胞克隆的构建

甲胎蛋白(AFP)是一种重要的胚胎期及肝癌相关蛋白,为了深入研究其在肝癌细胞增殖中的作用,构建了针对AFP基因的shRNA表达质粒,拟建立可稳定转染的肝癌细胞克隆;利用生物信息学方法设计shRNA,经酶切连接和抗生素筛选构建表达质粒;通过酶切、琼脂糖凝胶电泳及测序对质粒加以验证;优化转染条件后采用脂染法转染肝癌SMM C-7721细胞,利用Purom yc in筛选稳定转染的细胞克隆.成功获得高特异的shRNA设计结果,构建了针对人类AFP基因的shRNA表达质粒,并获得该质粒稳定转染的细胞克隆.     

靶向沉默人HER2/neu基因的RNA干扰

针对人HER2/neu基因的mRNA序列, 设计并构建shRNA干扰载体, 经聚合酶链式反应(PCR)及测序鉴定后转染SK-BR-3细胞, 并检测HER2/neu mRNA和蛋白抑制情况及SK-BR-3细胞迁移能力的变化. 实验结果表明： 构建了3个HER2/neu shRNA真核表达质粒; 3个重组质粒均可不同程度下调HER2/neu mRNA和蛋白表达水平, 并抑制SK BR 3细胞的迁移; 其中1号重组质粒效应最强, 对mRNA和蛋白的抑制率分别为84.65%和7498%.     

重组慢病毒介导的NMD途径因子UPF1和SMG1可诱导干扰细胞株的构建

无义介导的mRNA降解途径是一个比较完善的异常mRNA的降解机制,结合在外显子拼接复合体上的多种蛋白决定NMD途径对异常转录物的识别和降解的启动,其中UPF1和SMG1发挥主要功能.UPF1是一个RNA解旋酶和RNA依赖的ATP酶;而SMG1具有磷脂酰肌醇激酶活性,负责UPF1的磷酸化.本研究构建了含有UPF1和SMG-1基因发夹结构的诱导开关基因表达干扰质粒.利用慢病毒介导转化哺乳动物细胞HEK293T细胞得到重组病毒,经鉴定后感染细胞AD_293,目的基因在细胞中得以高效表达.通过继代培养和单克隆化,得到强力霉素诱导干扰UPF1和SMG-1表达的稳定细胞株.     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

靶向srGAP家族的串联短发夹RNA表达

为了解析不同srGAP蛋白在神经元发育中的补偿效应,构建了一种同时靶向srGAP家族成员srGAP1~3的串联短发夹RNA表达系统.通过设计,合成多个寡核苷酸,利用微小RNA表达载体构建相应srGAP基因的短发夹RNA表达质粒,并利用蛋白免疫印迹法筛选敲减作用明显的靶向不同srGAP基因的短发夹RNA,然后,将其串联到同一载体而构建成可以同时靶向srGAP家族的短发夹RNA串联重组质粒.结果表明,筛选得到了分别针对srGAP1~3的短发夹RNA J17、J24和J33,并构建出能够同时靶向srGAP1~3基因的串联短发夹RNA J1+2+3.     

慢病毒介导的HPV16-E7基因RNAi细胞模型的建立

 建立HPV16-E7基因的RNAi细胞模型,可为进一步研究HPV16-E7蛋白作用及致癌机制提供物质前提。选择HPV16-E7基因特异的siRNA片段,构建慢病毒siRNA重组表达载体,经293FT病毒包装细胞转染产生重组病毒,并以此感染HPV16阳性SiHa宫颈癌细胞、抗菌素筛选和分子生物学鉴定,建立了稳定表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型。该细胞模型,对目标基因（E7）表达的抑制效率,也以蛋白免疫印迹和RT-PCR确证。由此得出,利用慢病毒载体和HPV16-E7基因特异的siRNA片段,可以建立一种稳定、有效和可行的RNAi细胞模型,为进一步研究E7蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平，可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据．本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR—EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株，利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度．共使用20种哺乳动物细胞株，其中10种人类组织细胞，2种猴组织细胞。8种小鼠组织细胞．结果表明，重组痘苗病毒wR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳；整体看，痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞；对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞；但没有特别的组织偏嗜性。     

利用pGenesil-1.0构建人Dna2真核表达干扰载体

目的:构建人基因Dna2干扰(RNAi)的真核表达载体.方法:根据GenBank上人Dna2的cDNA序列设计并合成两条单链寡核苷酸,退火以后,插入质粒pGenesil-1.0多克隆位点的BamH I和Hind III之间进行重组,构建重组干扰载体,转化DH5α后测序鉴定出阳性菌株.重组质粒以脂质体法转染HeLa细胞,提取Dna2蛋白以免疫印迹法检验干扰效果.结果:设计的目的干扰序列5’-catagccagtagtattcgatg-3’可明显抑制Dna2在HeLa细胞的表达.结论:利用pGenesil-1.0构建的人Dna2干扰载体适用于该基因功能研究.     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。