农药分子核酸适体筛选研究进展及其在生物传感器中的应用

核酸适体作为一类通过体外筛选指数富集配体系统进化技术(SELEX)得到的单链DNA或RNA,具有特异性强、稳定性好和靶分子广等特点,被广泛用于生化传感检测领域.总结了近年来筛选的农药分子核酸适体及其筛选方法,综述了农药分子核酸适体在生物传感检测中的应用,并探讨了农药分子核酸适体筛选的问题和未来发展的趋势.     

水生生物病原核酸适配体研究进展

核酸适配体(Aptamer)是指利用指数富集配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到的能特异性识别和结合靶标的ssDNA或RNA分子,具有高亲和力和高特异性的特点,在快速检测和靶向治疗方面应用广阔。近年来,水生生物细菌和病毒性病原疾病的频繁暴发,严重制约了水生态的健康以及水产养殖业的迅速发展。核酸适配体作为一种新型的识别分子,在水生生物病原的应用上也已取得了一些进展。本文对水生生物细菌和病毒性病原核酸适配体的筛选,及其在检测和治疗领域的研究现状进行综述,并对该领域核酸适配体技术的应用方向进行展望。     

分子元素与功能核酸分子

 介绍了"分子元素"概念。论述了核酸适体的筛选及其作为大分子药物的应用价值,概述了人工碱基的合成及进展;探讨了脱氧核酶的作用原理,分析了分子信标、分子马达在生物传感、生物合成、生物药物研究等方面的应用前景,展望了核酸分子研究领域的前景及面临的挑战。     

基于恒温无蛋白酶核酸扩增反应的生物传感器研究进展

恒温无蛋白酶的核酸扩增反应具有操作简单、条件温和、反应效率高,以及不需要温度循环和蛋白酶参与的特点,可以实现对生物分子的高灵敏检测,已经被广泛应用于生物分析和生物医学应用等领域.本文总结了近年来基于恒温无蛋白酶的核酸扩增反应的生物传感器在检测领域中的发展和应用,并对当前存在的问题进行了讨论.     

基于亲和超滤技术的天然活性物质筛选方法

药效物质与药物靶标的相互作用是其生物活性的基础,利用药物靶标亲和选择性“钩钓”其特异性配体,可以实现复杂提取物中天然活性物质分析的“精准制导”.亲和超滤是一种以上述原理为基础,将亲和捕获与超滤分离相结合以实现化合物高通量筛选的技术,具有快速、简单、高效等特点,常与液质联用等分析技术联合使用,克服了天然活性物质筛选研究面临的诸多问题,近年来被广泛应用于天然活性物质的快速靶向筛选.本文从亲和超滤技术本身的原理、影响因素及与其他分析技术的联用情况等方面,详细综述了亲和超滤技术的特点和应用现状,以期为构建天然活性物质的快速筛选策略提供科学思路和依据.     

特异性检测卵形鲳鲹源哈维氏弧菌的核酸适配体的筛选与鉴定

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物常见的主要致病菌之一,严重危害着我国华南沿海地区水产养殖业的健康可持续发展。针对哈维氏弧菌的快速检测诊断技术和抑菌技术等方面进行系统研究,并开发具有市场发展潜力的快速检测试剂盒和抗菌功能产品,对控制哈维氏弧菌的危害极其重要。为此,本研究以哈维氏弧菌为靶标,利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术,筛选特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体,并对核酸适配体的性质进行系统性研究。结果显示,核酸适配体H10、H13能高特异性和高亲和性地识别哈维氏弧菌,并且无毒副作用。同时,靶标性质分析表明核酸适配体(H10,H13)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。本研究运用SELEX技术筛选获得的ssDNA核酸适配体H10和H13,具有高特异性和亲和性,可用于研发操作便捷、灵敏度高的哈维氏弧菌快速检测技术。     

RNA切割型脱氧核酶在生物医学领域中的研究进展

RNA切割型脱氧核酶（RCD）是一类具有催化活性的单链DNA分子,具有灵活的可编程性、优异的稳定性、强底物特异性和高催化活性等优点,因而在生物医学领域展现出了良好的应用前景. 基于RCD对于特定辅助因子的依赖和对于靶标RNA的特异性识别和切割,其被广泛应用于一系列生物分子靶标的检测以及多种临床疾病的基因治疗. 文章介绍了RCD的物理化学特性,并对其在生物医学领域的研究现状进行了总结,聚焦于RCD在生物传感和癌症治疗等方面的应用进展. 此外,还对该领域面临的挑战及未来的发展方向进行了讨论.     

基于水溶性共轭高分子构象效应的凝血酶检测

介绍了水溶性共轭高分子和核酸适体(aptamer)在生物传感检测中的应用.提出了一种基于aptamer和水溶性聚噻吩的构象效应进行凝血酶检测的比色方法.结果表明,该方法具有较高的选择性和灵敏度,肉眼目测最低可检测63 nM凝血酶.     

大肠杆菌核酸适配体筛选的研究

由于传统微生物检测存在步骤繁琐、耗费时间、成本较高等缺点,因此研发快速有效检测微生物的新技术新方法显得尤为必要.本文利用whole-cell SELEX技术,进行了大肠杆菌活细胞核酸适配体的筛选,对单链DNA的制备鉴定、每轮筛选核酸文库的检测、核酸适配体的扩增克隆等内容进行了研究,在筛选过程中成功制备了单链DNA,并对整个筛选过程的核酸适配体库进行监测,保证了筛选的顺利进行,并对核酸适配体库进行了扩增和克隆,最终获得靶向大肠杆菌的核酸适配体序列,这将有助于基于核酸适配体的微生物检测新方法的建立.     

拉曼光谱技术的发展及其在生物医学领域中的应用

拉曼光谱技术自发现以来广泛应用于检测固体和液体材料的化学成分,它可利用物质的光谱"指纹"信息,区分各种物质样品、检测不同生理状况的细胞及其中的生物分子,如核酸、蛋白质等.为探索拉曼光谱在生物医学领域的应用前景,在概述拉曼光谱原理的基础上,介绍拉曼光谱技术及其衍生出的其他技术,包括表面增强拉曼散射(SERS)、共振拉曼光谱(RRS)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)、受激拉曼光谱(SRS)技术等,最后对拉曼光谱的改进与应用提出展望.     

Near-infrared fluorescent aptamer-templated silver nanoclusters facilely synthesized for cellular imaging applications

Fluorescent metal nanoclusters(NCs)have received extensive attention for their potential uses in bionanotechnology.Here,we develop a facile strategy to synthesize near-infrared fluorescent silver nanoclusters(Ag NCs)stabilized by MUC1 aptamer.The MUC1-Ag NCs are characterized by UV–Vis absorption spectroscopy,fluorescence spectroscopy,transmission electron microscopy,and fluorescence lifetime.These results indicated that the MUC1-Ag NCs possess bright near-infrared luminescence,high stability,and excellent biocompatibility.The cellular imaging of MUC1-Ag NCs by confocal laser microscopy demonstrated them to be promising candidates as novel fluorescent probes for biomedical application.     

电化学可卡因适体传感器的研制

 采用自组装法将带巯基的捕获DNA探针固定到金电极表面,利用杂交反应将可卡因适体固定到电极上制得可卡因适体传感器.以钌联吡啶为电活性指示剂,检测适体与目标分析物——可卡因特异性结合后,电化学活性物质钌联吡啶的电信号的降低,实现对可卡因的定量检测.考察了缓冲液的pH,扫描速度,DNA探针及适体固定时间等条件对传感器测定可卡因信号响应的影响.结果表明在pH7.4时该传感器检测的范围为2×10^-4～1.0×10^-3mol/L,检测下限为6×10^-5mol/L.该传感器稳定性好,抗干扰能力强.     

人骨肉瘤细胞适配体的早期筛选

目的体外随机合成单链寡核苷酸备选文库,以骨肉瘤U-2 OS完整细胞作为靶点,筛选出与其结合的高特异性、高亲和性单链DNA(ss DNA).方法将体外合成随机碱基序列的单链DNA文库与人骨肉瘤U-2 OS细胞相结合,收获与靶细胞结合的单链DNA,通过优化PCR条件进行大量扩增后,应用生物素-链霉亲和素亲和层析柱分离出正链DNA.结果以10,14以及18个循环时扩增ds DNA产物最理想;应用生物素-链霉亲和素磁珠分离法制备的正链ss DNA纯度高,可有效保证次级文库的筛选.结论应用Cell-SELEX技术可成功筛选早期ss DNA文库,为后续获得针对人骨肉瘤U-2 OS细胞的高特异性适配体奠定实验基础.     

磷硫代siRNA的抗肿瘤基因沉默活性研究

由于目前尚无高效合成立体特异性磷硫代siRNAs(PS-siRNAs)的化学体系,本研究针对潜在的癌症治疗靶点PLK1,用a-磷硫代三磷酸腺苷(ATPaS)、a-磷硫代三磷酸胞苷(CTPaS)和a-磷硫代三磷酸尿苷(UTPaS)通过T7RNA聚合酶转录合成了部分磷硫代修饰的Rp-磷硫代siRNAs(Rp-PS-siRNAs),探究了nat-siRNAs和PS-siRNAs血清稳定性和基因沉默活性的差异性。发现酶促合成的磷硫代siRNA几乎不影响siRNA的基因沉默效率,但却显著提高siRNA的血清稳定性。因此,酶促转录合成的Rp-PS-siRNA可望作为siRNA的修饰形式,以延长siRNA的生物活性半衰期,使siRNA广泛应用于生物医学临床研究领域。     

结合适配体技术的磁性粒子表面蛋白分子印迹材料研制

本文将具有高度特异性的生物分子核酸适配体引入分子印迹技术,并结合磁性纳米粒子材料比表面积大、操作简便性和易于修饰性于一体,制备出了新型蛋白分子印迹材料.首先获得性能更好的硅烷化的磁性微球,之后加入功能单体、交联剂和衍生化适配体,以溶菌酶为模板分子,制备出磁性溶菌酶蛋白分子印迹适配体-纳米粒子.实验结果显示,不同材料的蛋白吸附能力顺序由高到低分别为结合适配体的蛋白印迹材料,结合适配体的非蛋白印记材料,蛋白印迹材料和无适配体的非蛋白分子印记材料.初步研究表明,适配体与磁性粒子的结合可以有效提高蛋白质分子印迹材料的印迹效果.     

Study on the specific interaction between angiogenin and aptamer by atomic force microscopy （AFM）

The specific interaction between angiogenin and aptamer has been investigated by using AFM. The specificity of the interaction is revealed by comparing the binding probability of aptamer to other elements in a series of control experiments. The results have shown that there is specific interaction force between angiogenin and aptamer. Moreover, the single molecular pull-off force between angiogenin and aptamer has also been determined using the Poisson statistical method to be 133.7±11.7 pN. These findings obtained are helpful to the better revelation of recognition mechanism between angiogenin and aptamer, which provided basis for further understanding the inhibition of the aptamer to angiogenic activity.     

Detection of immunoglobulin E using an aptamer based dot-blot assay

A novel aptamer based dot-blot assay for the detection of immunoglobulin E (IgE) was developed. A biotinylated aptamer was employed as the bio-recognition element to specifically interact with the target protein immobilized onto a nitrocellulose membrane substrate. Avidin conjugated horseradish peroxidase was introduced onto the membrane through the biotin-avidin system to catalyze the hydrogen peroxide mediated oxidation of 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine, thereby producing the blue-colored insoluble product. The intensity of the dots increased as the concentration of IgE increased. The spot intensity was quantified using a simple portable instrument. A linear response relationship between the spot intensity and the concentration of IgE over the range of 50 nmol/L to 1 μmol/L was obtained. The detection limit for IgE using the aptamer-based assay was 2.89 nmol/L. This assay was found to discriminate IgE from non-target proteins such as thrombin, bovine serum albumin and immunoglobulin G.     

Stable silver nanoparticles–aptamer bioconjugates for cellular prion protein imaging

Combining the unique optical properties of metal nanoparticles and the specific recognition of aptamer,aptamer–nanoparticle conjugates have been extensively used in a wide range of applications,particularly multifunctional nanoparticles for cell detection and molecular imaging.Conventional conjugates prepared by chemisorption of monothiol-modified oligonucleotides onto nanoparticle surfaces suffer from a lack of stability when exposed to a variety of small molecules.If silver is used in place of gold,then this lack of stability is even more pronounced.In this study,we reported here the effective and facile strategy of preparing stable silver nanoparticle–aptamer conjugates by in situ generation of strong metal affinity capping ligands,dithiocarbamates modified anti-prion protein aptamer.The conjugates produced are stable and can withstand NaCl concentration at0.25 mol/L.Meanwhile,they could be applied in the cellular prion protein imaging successfully.     

核酸适配体氯化血红素比色法检测牛奶中的氯霉素

利用一种基于适配体氯化血红素(hemin)比色分析法快速检测牛奶中的氯霉素(chloramphenicol,CAP) 含量。设计两条DNA链,其中一条为CAP的核酸适配体,在其3′端修饰氯化血红素;另一条为CAP核酸适配体的互补链(cDNA),在其5′端修饰hemin。当体系中无CAP时,两条DNA单链杂交形成DNA双链,两个hemin单体形成二聚体使其过氧化物酶活性降低,以致不能催化过氧化氢氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)产生蓝色产物。而体系中有CAP时,CAP与CAP适配体特异性结合,DNA双链解离,hemin单体的过氧化物酶活性恢复,并催化过氧化氢氧化TMB产生蓝色产物,加入反应终止液后,检测452 nm处的吸光度值。在优化条件下,该比色法检测CAP的线性范围为1～30 nmol·L-1,以3倍标准偏差计算其检出限为0.315 nmol·L-1。将该方法用于牛奶样品的检测,加标回收率为955%～1160%,表明该方法能够快速、准确和灵敏地检测牛奶中CAP含量。     

降低酶联核酸适配体分析方法中非特异性吸附的分析研究

以检测蜂蜜中的四环素残留为例，构建间接竞争酶联核酸适体分析法（ic-ELAA），就ic-ELAA中非特异性吸附的影响因素进行分析，探讨降低非特异性吸附的措施。结果表明：选择2 μg/mL四环素-牛血清蛋白在10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）中过夜包被，次日用0.5 g/mL酪蛋白封闭1 h，竞争反应后用6 μg/mL链霉亲和素-辣根过氧化物酶催化颜色反应放大竞争效果，最后采用450 nm和630 nm双波长读数，可得到灵敏度为0.035 ng/mL的竞争曲线。同时，根据长期实验经验，提出其他降低非特异性吸附的注意事项。