特异性检测卵形鲳鲹源哈维氏弧菌的核酸适配体的筛选与鉴定

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物常见的主要致病菌之一,严重危害着我国华南沿海地区水产养殖业的健康可持续发展。针对哈维氏弧菌的快速检测诊断技术和抑菌技术等方面进行系统研究,并开发具有市场发展潜力的快速检测试剂盒和抗菌功能产品,对控制哈维氏弧菌的危害极其重要。为此,本研究以哈维氏弧菌为靶标,利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术,筛选特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体,并对核酸适配体的性质进行系统性研究。结果显示,核酸适配体H10、H13能高特异性和高亲和性地识别哈维氏弧菌,并且无毒副作用。同时,靶标性质分析表明核酸适配体(H10,H13)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。本研究运用SELEX技术筛选获得的ssDNA核酸适配体H10和H13,具有高特异性和亲和性,可用于研发操作便捷、灵敏度高的哈维氏弧菌快速检测技术。     

秦皮水提物和秦皮乙素抗石斑鱼虹彩病毒的研究

为开发绿色、安全、高效的抗石斑鱼虹彩病毒(Singapore Groupe Riridovirus, SGIV)渔用药物,本研究先采用光学显微镜观察、CCK-8细胞活力测定实验确定秦皮水提物(Cortex Fraxini water extracts, CFE)及其主要活性成分秦皮乙素(Esculetin, EC)的细胞安全浓度,并在确定药物安全工作浓度基础上,分别采用光学显微镜观察、实时荧光定量PCR (Realtime Quantitative, RT-qPCR)、基于核酸适配体LYGV1的荧光分子探针技术(LYGV1-AFMP)等方法探究CFE和EC抗石斑鱼虹彩病毒的效果。结果表明,当CFE浓度低于1 mg/mL、EC浓度低于10μg/mL时,光学显微镜观察结果显示细胞形态正常,无明显病变效应。光学显微镜观测结果与CCK-8检测细胞存活率结果一致,即秦皮水提物安全工作浓度为1 mg/mL(ρ_(CFE)≤1 g/L),秦皮乙素安全工作浓度为≤10μg/mL(ρ_(EC)≤0.01 g/L)。光学显微镜观察、RT-qPCR、LYGV1-AFMP这3种检测技术均证实秦皮水提物及秦皮乙素具有明显的抗石斑鱼虹彩病毒效果,且在安全工作浓度下,抗病毒效果与药物剂量呈正相关关系。秦皮水提物及秦皮乙素能够有效抑制石斑鱼虹彩病毒的感染,具有开发成高效抗病毒渔用药物的潜力。     

黑鲷NKCC1分子特征及其对急性盐度胁迫的表达响应

为了解黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)在盐度胁迫过程中的适应机制,本研究利用基因扩增、聚类分析、荧光定量PCR等技术对NKCC1基因进行生物信息学分析以及在不同组织中的表达特征研究,并探讨其在急性盐度胁迫下的表达机制。结果表明NKCC1基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为3 504 bp,共编码1 167个氨基酸,预测蛋白分子量为127.19 kDa,理论等电点为5.75。结构域分析表明黑鲷NKCC1分子为跨膜蛋白,并包含一个典型的Na~+-K~+-Cl~-共同转运蛋白SLC12A结构域,且在不同物种中具有很高的保守性;序列比对分析表明黑鲷NKCC1氨基酸序列与金头鲷NKCC1a的同源性最高,为97.8%;组织表达分析表明黑鲷NKCC1基因在所检测的12个组织,即肝脏、肾脏、心、脑、眼、鳃、鳍条、脾脏、皮肤、肠、性腺和白肌中均有表达,其中在肾脏、鳃和肠中表达量最高,并显著高于其他组织(P0.05);在低盐度胁迫下,NKCC1基因在鳃组织中的表达量对盐度变化响应十分迅速,而在肾脏组织中,低盐度和高盐度胁迫都会在不同时间点抑制NKCC1基因的表达量。综上所述,本研究为解析NKCC1基因在黑鲷调节渗透压和离子平衡过程中的功能机制奠定了基础,并为促进黑鲷养殖产业的可持续发展提供一定的技术理论。     

威灵仙水提物对卵形鲳鲹源溶藻弧菌的抑制作用

近年来水产养殖行业不断扩大,但随之而来的鱼病对养殖行业造成了巨大损失。本研究以卵形鲳鲹(前期发病)上分离出的溶藻弧菌为实验对象,批量筛选多种中草药,选择抑菌效果最好的一种或几种中草药,并探究不同浓度中草药水提物的抑菌效果,确定其杀菌浓度(MBC)及最小抑菌浓度(MIC),再通过生化指标胞内乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)的含量来确定其杀菌机制。对大量中草药水提物的筛选结果表明,威灵仙水提物对溶藻弧菌具有较好的抑制作用;通过二倍稀释法将威灵仙水提物进行逐级稀释后,发现其对溶藻弧菌的致死浓度为500 mg/mL,最小抑菌浓度为250 mg/mL;孵育2 h后,实验组胞内LDH的含量明显比对照组含量低,并且随着时间的推移,对照组含量先升高后降低,而实验组含量逐渐减少,实验组与对照组胞内LDH含量出现显著性的差异。威灵仙水提物致死溶藻弧菌有可能是通过破坏细胞膜,使细胞内容物释放从而引起菌体裂解。