特异性检测卵形鲳鲹源哈维氏弧菌的核酸适配体的筛选与鉴定

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物常见的主要致病菌之一,严重危害着我国华南沿海地区水产养殖业的健康可持续发展。针对哈维氏弧菌的快速检测诊断技术和抑菌技术等方面进行系统研究,并开发具有市场发展潜力的快速检测试剂盒和抗菌功能产品,对控制哈维氏弧菌的危害极其重要。为此,本研究以哈维氏弧菌为靶标,利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术,筛选特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体,并对核酸适配体的性质进行系统性研究。结果显示,核酸适配体H10、H13能高特异性和高亲和性地识别哈维氏弧菌,并且无毒副作用。同时,靶标性质分析表明核酸适配体(H10,H13)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。本研究运用SELEX技术筛选获得的ssDNA核酸适配体H10和H13,具有高特异性和亲和性,可用于研发操作便捷、灵敏度高的哈维氏弧菌快速检测技术。     

秦皮水提物和秦皮乙素抗石斑鱼虹彩病毒的研究

为开发绿色、安全、高效的抗石斑鱼虹彩病毒(Singapore Groupe Riridovirus, SGIV)渔用药物,本研究先采用光学显微镜观察、CCK-8细胞活力测定实验确定秦皮水提物(Cortex Fraxini water extracts, CFE)及其主要活性成分秦皮乙素(Esculetin, EC)的细胞安全浓度,并在确定药物安全工作浓度基础上,分别采用光学显微镜观察、实时荧光定量PCR (Realtime Quantitative, RT-qPCR)、基于核酸适配体LYGV1的荧光分子探针技术(LYGV1-AFMP)等方法探究CFE和EC抗石斑鱼虹彩病毒的效果。结果表明,当CFE浓度低于1 mg/mL、EC浓度低于10μg/mL时,光学显微镜观察结果显示细胞形态正常,无明显病变效应。光学显微镜观测结果与CCK-8检测细胞存活率结果一致,即秦皮水提物安全工作浓度为1 mg/mL(ρ_(CFE)≤1 g/L),秦皮乙素安全工作浓度为≤10μg/mL(ρ_(EC)≤0.01 g/L)。光学显微镜观察、RT-qPCR、LYGV1-AFMP这3种检测技术均证实秦皮水提物及秦皮乙素具有明显的抗石斑鱼虹彩病毒效果,且在安全工作浓度下,抗病毒效果与药物剂量呈正相关关系。秦皮水提物及秦皮乙素能够有效抑制石斑鱼虹彩病毒的感染,具有开发成高效抗病毒渔用药物的潜力。     

基于核酸适配体Q5的石斑鱼虹彩病毒快速检测技术

石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus,SGIV)在不同鱼群之间迅速传播,其致死率极高,严重制约了我国海水石斑鱼(Epinephelus tauvina)养殖业健康可持续发展。为了及早发现和鉴定出病原,降低经济损失,促进渔业发展,开发方便快捷的石斑鱼虹彩病毒检测技术已迫在眉睫。本研究基于核酸适配体Q5,研发出一种核酸适配体Q5-荧光分子探针(Aptamer Q5-based fluorescent molecular probe,Q5-AFMP),并且对Q5-AFMP检测感染石斑鱼虹彩病毒的特异性,以及Q5-AFMP在细胞水平和组织水平检测石斑鱼虹彩病毒感染的灵敏度进行分析。研究结果表明:Q5-AFMP能够在细胞水平和组织水平高特异性检测出石斑鱼虹彩病毒的感染,而且具有较高的灵敏度。因此Q5-AFMP能够用于石斑鱼虹彩病毒的快速检测和诊断。     

威灵仙水提物对卵形鲳鲹源溶藻弧菌的抑制作用

近年来水产养殖行业不断扩大,但随之而来的鱼病对养殖行业造成了巨大损失。本研究以卵形鲳鲹(前期发病)上分离出的溶藻弧菌为实验对象,批量筛选多种中草药,选择抑菌效果最好的一种或几种中草药,并探究不同浓度中草药水提物的抑菌效果,确定其杀菌浓度(MBC)及最小抑菌浓度(MIC),再通过生化指标胞内乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)的含量来确定其杀菌机制。对大量中草药水提物的筛选结果表明,威灵仙水提物对溶藻弧菌具有较好的抑制作用;通过二倍稀释法将威灵仙水提物进行逐级稀释后,发现其对溶藻弧菌的致死浓度为500 mg/mL,最小抑菌浓度为250 mg/mL;孵育2 h后,实验组胞内LDH的含量明显比对照组含量低,并且随着时间的推移,对照组含量先升高后降低,而实验组含量逐渐减少,实验组与对照组胞内LDH含量出现显著性的差异。威灵仙水提物致死溶藻弧菌有可能是通过破坏细胞膜,使细胞内容物释放从而引起菌体裂解。