高产耐热3''''-磷酸二酯酶菌种的选育及酶性质的研究

以粘红酵母(Rhodotorula glutinis)Q0402为出发菌株,经紫外谤变,得到一株粘红酵母QX0402.5 L发酵罐的发酵液中3'-磷酸二酯酶酶活力可达250 U/mL,为文献报道过的最高酶活力的2.5倍.所产生的3'-磷酸二酯酶在70℃下保温1 h,酶活力仍有50%以上.该酶最适反应pH为5.4,最适反应温度为60℃,反应3 h的反应转化率为56.37%,底物浓度可以提高到3%,生产效率为文献报道的3倍.     

麦芽根中5′-磷酸二酯酶的制备及性质

从麦芽根中提取5′－磷酸二酯酶，酶活可达474U／mL。将所得酶液用于水解酵母核糖核酸，得到5′－CMP、UMP、GMP、AMP4种单核苷酸。最佳反应条件为：底物RNA浓度为0.01g/mL，每毫升底物的酶用量为30U，酶解温度70℃，pH7.0，时间2h,5′－核苷酸转化率达80％。     

麦芽根中5′-磷酸二酯酶的分离提纯及其固定化

从麦芽根中分离得到了5’-磷酸二酯酶,采用戊二醛为交联剂,将该酶固定到壳聚糖上,用于酵母RNA的催化水解,以制备5’-核苷酸．研究了酶固定化反应的影响因素,在最适条件下,酶活回收率可达53．6％．进一步研究了固定化5’-磷酸二酯酶的酶学性质,测得固定化酶的米氏常数‰为15．38mg／mL（以RNA为底物）,固定化酶催化水解RNA的最适温度75℃,最适pH值为5．5,实验发现固定化5’-磷酸二酯酶具有更好的耐热性和更高的纯度．     

产朊假丝酵母细胞壁33kD蛋白的酶学特性研究

培养产朊假丝酵母菌收获菌体,经裂解酶处理细胞壁,离心后得到上清粒酶液,粗酶波经DEAE-纤维素层析、Sepharose4B凝胶过滤纯化。对33kD蛋白的酶学性质研究表明,反应最适pH为5．5,反应的最适温度为45℃。热稳定性较差,50℃温度下放置1h活力下降50％。主要水解β-1,3-倍苦键,具有较强的专一性,是一种典型的葡聚糖内切酶（对pNPG无作用）。     

枯草芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因序列设计引物,以pHBM003为模板,扩增得到寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因,克隆至毕氏酵母（Pichia pastoris）表达载体pHBM905上,获得重组毕氏酵母表达载体pHBM9053．将此质粒分别转化毕氏酵母GS115、KM71和SMD1168菌株,筛选获得重组毕赤酵母GS115（pHBM9053）、KM71（pHBM9053）和SMD1168（pHBM9053）;然后进行摇瓶诱导培养,这3株毕氏酵母分别在诱导培养60h、48h和24h后,酶活力达到最高,对应为2．233u／mL、0．34u／mL和1．235u／mL;GS115（pHBM9053）所产寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的最适反应温度为75℃,最适反应pH值为6,在30～75℃、pH8～9范围内较稳定．     

以产气肠杆菌催化肌苷5′-位磷酸化的特性

为了分析磷酸酶在菌体细胞内的存在方式、酶反应特征及产物结构,以产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)细胞作为催化剂,以焦磷酸和肌苷为底物,并采用液相色谱和核磁共振等方法进行了研究。酶促反应产物被证实为5′-IMP。结果表明:该酶为胞内酶,具有可溶性的特点;酶促反应温度范围30~40℃,最适温度为35℃;整细胞酶促反应的最适pH值为4.8,催化16 h可以合成4.79 mg.mL-1的5′-IMP;破碎细胞,酶促反应的最适pH值为7.6,催化10 min可以合成5.85 mg.mL-1的5′-IMP。     

提高酵母精呈味特性和得率的研究

研究结果表明:以13～15%的酵母悬浮液,外加干酵母重1. 0%的蛋白酶及0. 1%的乙酸和半胱氨酸,调节 pH6. 2～6. 4,在40MPa 压力下均质三次,然后在48℃自溶24h,自溶完后抽提出来未降解的 RNA,外加11. 0%麦芽根提取的5′-磷酸二酯酶粗酶液在 pH5. 5.65℃恒温3h,定向地将RNA 分解为5′-核苷酸,得到的酵母精具有浓郁的鲜香味,不带酵母味,且得率比对照提高48. 3%,达75. 5%;氨基氮提高40. 5%,达5. 9%;5′-GMP 含量提高20. 6倍,含量1. 65%;自溶时间缩短三分之一。     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

苯丙氨酸解氨酶菌株的选育及L─苯丙氨酸的合成

本文以粘红酵母ＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓＡＳ２．１０２，１００１－２Ｏ－６Ｒ和深红酵母ＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｒｕｂｒａＡＳ２．２７９为出发菌株，经紫外诱变筛选得到一株苯丙氨酸解氨酶高活力菌株Ｒｈ．ｇｌｕｔｉｎｉｓＮＣ０６，其酶活力是亲株１００１－２０－６Ｒ的１．５倍。在最适转化条件下，肉桂酸转化率达５７．７％，每升转化液生成Ｌ－苯丙氨酸１１．５４克，另外对ＮＣ０６的生理特性进行了初步研究。     

枯草芽孢杆菌2-3-2的抗线虫作用和产酶条件与酶特性

为了研究枯草芽孢杆菌2-3-2抗线虫作用与几丁质酶活的关系,对几丁质酶的产酶条件进行优化并探讨酶的特性,通过盆栽试验测定了抗线虫效果,用DNS定糖法测定了几丁质酶活力.实验结果表明:枯草芽孢杆菌2-3-2对南方根结线虫防治效果显著,其抗线虫作用与几丁质酶活性呈正相关.几丁质酶产酶培养基组成为(g/L):胶体几丁质65,酵母膏1,葡萄糖5,KH2PO40.7,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO40.01,NaCl 0.5,微量盐1mL/L;起始pH 7.0,温度为30℃、培养时间为72h.与优化前相比,酶活性提高了1.59倍,达到35.17×10-10 mol/s.枯草芽孢杆菌2-3-2几丁质酶最适反应温度为40℃,最适pH为7.0;温度高于50℃及碱性条件下酶活力下降.     

β-葡萄糖苷酶高产菌株及其应用研究

 对Hypocrea sp. W₆₃的β-葡萄糖苷酶酶学性质研究表明,该酶液体发酵最高酶活高达482.1 U/mL,最适反应pH值为4.8,最适反应温度为65 ℃;乙醇体积分数为10%时对酶活有最大促进效果,乙醇耐受能力高达30%;将该酶应用于同步糖化发酵研究中,发现发酵至120 h乙醇质量浓度可高达41.25 g/L,与对照相比,乙醇产量均提高近2倍。该菌株所产的β-葡萄糖苷酶较高的酶活力、耐热性能、乙醇耐受性和同步糖化发酵促进效果,预示着该菌在纤维素乙醇产业化应用中具有广阔的应用前景。     

克雷伯杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质

在有氧条件下,利用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子离子交换层析和Blue Sepharose CL-6B亲和层析,同时分离并提纯克雷伯杆菌胞内的1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶.研究表明,1,3-丙二醇氧化还原酶的纯化倍数为35.86倍,回收率为5.17%,该酶最适表观反应温度为57 ℃,最适反应pH值为9.5.在30 ℃及pH=8.0～10.0时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH=9.5条件下,该酶以1,3-丙二醇和NAD+为底物,其米氏常数Km分别为15.8,0.2 mmol·L-1.1,3-丙二醇氧化还原酶对生理反应底物3-羟基丙醛活性最大,对其他醇类也有氧化能力.Mn2+对酶有显著激活作用,巯基保护剂能明显提高酶的活力.     

生物转化肉桂酸制L-苯丙氨酸

研究了利用粘红酵母中的L-苯丙氨酸解氨酶催化反式肉桂酸转化成L-苯丙氨酸的基本条件,包括底物浓度、pH值、反应温度、时间、表面活性剂对转化率的影响.结果表明,粘红酵母在底物浓度为1%,溶液的pH值为10.0,反应温度为30℃,时间为3 h时,反式肉桂酸的转化率达40.1%.     

利用脂肪酶Novozym 435催化转酯反应对映选择性合成(R)-α-硫辛酸的手性前体

利用商品脂肪酶Novozym 435介导的对映选择性转酯反应催化拆分(R,S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯(ECHO),以合成(R)-α-硫辛酸的手性前体。对酶促拆分反应的条件进行了优化,确定了该酶的最适反应条件:以乙酸乙烯酯为酰基供体,最适反应温度为50°C,以异丙醚为反应介质,酶最适上载量为100g/mol ECHO,可以耐受的底物浓度为1mol/L。在产品的克级制备反应中,6h底物转化率为47%,产物(R)-6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的对映体过量值(eep)为90%,时空产率高达471g/(L·d),产品总收率为36.3%。该酶法催化的转酯化反应为(R)-α-硫辛酸的合成提供了一条新的途径。     

分子形貌半经验方法——快速预测Dpb的应用

C-H强弱在理解DNA和RNA的损坏机理中起着非常重要的作用,得到了许多学者们的关注.以3′,5′-二磷酸核酸为模型分子,应用分子形貌半经验理论方法,使用MELD精密从头计算及自编程序快速计算了8种化合物沿着C-H方向上的Dpb.通过分析沿着C-H方向上的Dpb,预测了化合物中C-H键的强弱,并获得了可能发生H-提取反应的活动顺序.通过计算DNA和RNA分子中糖基沿着C-H方向上的Dpb,预测发生H-提取反应难易程度的顺序分别为C1′-H>C2′-H>C4′-H>C5′-H>C3′-H和C1′-H>C4′-H>C5′-H>C3′-H>C2′-H.计算获得的Dpb数值表明,DNA和RNA中发生H-提取的位点都为C1′-H,预测的结果与文献中基本一致,可以为进一步研究相似体系中发生H-提取反应本质提供参考.     

菊粉内切酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质测定

为了实现菊粉内切酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高活性表达并对表达的菊粉内切酶酶学性质、水解菊粉的产物进行分析。通过下载无花果曲霉菊粉内切酶基因的编码序列,做了密码子优化后进行全基因合成,然后在毕赤酵母GS115中表达。对表达的菊粉内切酶的酶活、最适反应温度、最适pH值、热稳定性进行了分析,最后对酶水解菊粉的产物进行了高效液相色谱(HPLC)分析。摇瓶表达的酶活力为420 U/mL,酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0。HPLC分析表明:表达的菊粉内切酶酶解底物菊粉的主要产物为低聚果糖,聚合度为3～5之间。构建的工程酵母可以高效表达菊粉内切酶,可以用于生产低聚果糖。     

溴氰菊酯降解菌Pseudomonas sp.P1-1-B3产酶条件的优化

农药降解酶对去除农药残留污染具有良好的应用前景.从海洋沉积物中筛选到一株高产溴氰菊酯降解酶的菌株Pseudomonas sp.P1-1-B3,研究了碳源、氮源、pH值、培养温度、培养时间、接种量及溴氰菊酯对菌株产酶的影响.结果表明,降解菌产酶的最适条件为:以可溶性淀粉作为碳源,m(蛋白胨):m(酵母浸膏)=2:1为氮源,pH 7.5,温度30℃,培养时间2 d,接种量3%,溴氰菊酯含量15μmol/L.在此条件下,菌株产酶的比活力最大为113.3 U/mg.该降解酶对溴氰菊酯的降解,在12 h内降解率达54.6%.     

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

新型3-(2-丙烯酸酯)-3-OBoc氧化吲哚化合物的合成研究

以各种取代的靛红作为起始原料,通过和丙烯酸酯先进行Morita-Baylis-Hillman反应,合成3-(2-丙烯酸酯)-3-羟基氧化吲哚化合物中间体,然后在DMAP的催化下,与(Boc)2O反应,合成了9个新型3-(2-丙烯酸酯)-3-OBoc氧化吲哚化合物(2a~2i),其中6个未见文献报道(2a~2f),产率为35%~62%,讨论了底物取代基对反应速度的影响。结构经1H NMR,13C NMR表征。     

磁性壳聚糖微球固定化漆酶的制备及酶学性质研究

以Cerrena sp. HYB07菌株所产漆酶为研究对象,制备磁性Fe_3O_4-壳聚糖固定漆酶.磁性壳聚糖微球固定化漆酶制备的最优条件为:磁性Fe_3O_4纳米颗粒0.4μg·mL~(-1)、戊二醛质量浓度4 mg·mL~(-1)、交联时间12 h、给酶量160 U·mL~(-1)、固定化时间8 h.在此条件下,漆酶固定化率为78.03%,固定化漆酶活力为97.19 U·g~(-1).酶学性质研究表明,固定化漆酶的最适反应pH值为3.0,最适反应温度为45℃.与游离酶相比,固定化漆酶的热稳定性有所提高.固定化漆酶用于蒽醌染料活性亮蓝脱色,具有良好的重复利用性,不仅染料脱色率优于游离酶,且在汞离子存在下也效果显著.