内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的高水平表达研究

低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)具有改善胃肠道环境、刺激和加强机体免疫反应、抑制肠道特定肿瘤的发生等生物活性.内切菊粉酶能够水解菊粉获得低聚果糖.为了实现内切菊粉酶的高表达,从无花果曲霉(Aspergillus ficuum ATCC16882)中克隆了内切菊粉酶编码基因INU2,并实现了在毕赤氏酵母中的重组分泌表达,摇瓶表达的酶活力为570.4U/mL.去除内切菊粉酶的内源性信号肽序列后,其重组表达水平显著提高,摇瓶表达的酶活力为1013.8U/mL,提高幅度77.7%.TLC分析表明:毕赤酵母重组表达的内切菊粉酶(不含内源性信号肽序列)能将2%长链菊粉水解为2～3个聚合度的低聚果糖.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达

【目的】研究生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达,提高酶的表达量和水解生淀粉的能力。【方法】利用In-fusionTM PCR克隆技术将淀粉结合域SBD无缝隙插入到黑曲霉糖化酶基因glu的5′端构建融合表达质粒pPIC9K-psg,实现融合酶基因psg在毕赤酵母GS115中的高效表达,并进行酶学性质研究。【结果】融合酶的最适作用条件及热稳定性均与原始酶无明显差别,但反应温度及pH值的范围更为宽泛,在反应温度60~70℃,pH值为4.0~7.0时均较稳定;融合酶PSG降解生淀粉的能力较原始酶PG提高29.6%,比原始菌株提高86.5%。【结论】淀粉结合域SBD的融合提高了糖化酶水解生淀粉的能力。     

黑曲霉内切葡聚糖酶系的基本酶学特征解析

基于黑曲霉(Aspergillus niger)CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510作为基因来源,本研究成功将其17个内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中进行了克隆表达.重组酶En4gA和En4gG对羧甲基纤维素钠具有较高酶活力,分别为11.67 U/m L和7.45 U/mL;而其他重组酶的酶活力为0.83～1.62 U/m L.此外,En3gA、En3gB、En3gC、En4gA和En4gB还可以水解茯苓多糖.酶学性质的研究表明,这些重组酶的最适作用温度和最适作用pH分别为45～65℃、pH 3.5～6.0,且分别在40～80℃和pH 2.0～7.0具有较好的热稳定性和pH稳定性.进一步通过底物水解特征、进化树以及碳水化合物活性酶(CAZy)分类系统将这些内切葡聚糖酶分为4类.良好的耐热性和耐酸性为这些重组酶在麦芽糖化、饲料颗粒化、纤维素乙醇、食品、纺织以及医药等行业的应用奠定了良好的基础.     

克鲁维酵母(K.hubeiensis)产菊粉酶的发酵参数研究

菊粉酶(inulinase)是一种降解菊糖B-2,1-D-果聚糖果糖苷键生成果糖或低聚果糖的水解酶.本研究在筛选菊粉酶高产菌株基础上,对产酶能力较强的l株湖北克鲁维酵母(Kluyvreromyces hubeiensis)的发酵产酶参数进行了优化;结果表明,该菌株在菊糖3%,蛋白胨3%,pH 5.0,30～37℃摇床培...     

偏甘油酯脂肪酶PrLip的重组表达及酶学性质表征

偏甘油酯脂肪酶因其独特的底物偏好性具有广阔的应用前景。研究从食品安全菌娄地青霉的基因组中发现了一个假定的偏甘油酯脂肪酶prlip基因,通过全基因合成技术获得该酶基因序列,并构建了PrLip组成型表达的毕赤酵母基因工程菌。工程菌在30℃发酵培养60h,发酵活力达到22.26U/mL。利用阴离子交换层析法纯化,获得纯度大于90%的脂肪酶PrLip。酶学性质研究发现该酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH值为7.0,40℃的半衰期为6h,水解及酯化反应证实PrLip是一种偏甘油酯脂肪酶。脂肪酶PrLip具有良好的温度耐受性及对大多数表面活性剂的耐受性,使其具有广阔的工业应用前景。     

重组毕赤酵母产匍枝根霉内切葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及其酶学性质研究

将来源于匍枝根霉的endoglucanase Ⅱ(egⅡ)在毕赤酵母中实现异源表达,对构建完成的重组毕赤酵母进行高密度发酵,制备目标酶蛋白．发酵液经 Ni 柱分离纯化,得到分子量大小约为38 kDa,比酶活为37．8 IU/mg的蛋白．酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为55℃,最适反应 pH 为4．8;Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋对egⅡ的酶活力有一定的激活作用,Cu2＋对egⅡ酶活有抑制作用,Mg2＋、Co2＋、Na＋和K＋等离子对该酶的催化活力没有明显影响;该酶以CMC-Na为底物时其反应米氏常数为2．04 mg/ml．     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。     

完全图Kn的{P5,C5}分解

图分解问题已在很多邻域中得到了广泛的应用。用P₅表示5个顶点的路，C₅表示5个顶点的圈，本研究讨论了完全图K_n分解成5个顶点的路P₅和圈C₅的存在性，给出完全图K_n存在{P₅,C₅}-强制分解的充分必要条件是n≥7(n≠8)，以及完全图K_n存在{P₅,C₅}-分解的充分必要条件是n≥5(n≠6)。     

黄樱桃-拐枣多糖-油橄榄果汁低糖复合果酱研制

以陇南黄樱桃鲜果为原料,添加油橄榄果汁和拐枣多糖等成分进行加工,研制低糖复合果酱。通过单因素试验对木糖醇、柠檬酸、拐枣多糖和油橄榄果汁添加量进行筛选。根据综合感官评分,采用Box-Benhnken中心组合设计试验,优化低糖复合果酱的配方。结果表明,低糖复合果酱的配方为黄樱桃果肉50%、木糖醇添加量为17.30%、柠檬酸添加量为0.17%、拐枣多糖添加量为0.43%、油橄榄果汁添加量为5.53% 时,添加0.15% 的氯化钠、0.02% 的氯化钙和0.05% 的D-异抗坏血酸钠,得到质地良好的复合果酱产品。所研制的复合果酱,酱体呈鲜黄,有光泽,甜酸适口,组织状态良好,可溶性固形物含量 55.69%、总糖为34.36%、pH为4.20、黏度为25.76 cm/30s,卫生指标符合国家标准。     

家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜结构的观察比较

为探讨家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜组织结构与其生活环境适应的关系,用光镜观察了3种动物视网膜的组织结构,测量了3种动物视网膜各层厚度、3个核层的胞核层数及胞核直径。用免疫组化观察了Nogo C蛋白在3中动物视网膜的表达情况。结果表明:家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜均由4层细胞构成,在显微镜下分为10层。家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜平均厚度分别为416.29、437.90、419.36μm。毛腿沙鸡视网膜内核层和节细胞层的层数比家鸽和灰斑鸠的多,视细胞数亦较家鸽和灰斑鸠的多。毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜内核层、内网层、节细胞层和神经纤维层4层厚度所占总厚度比例(分别为69.77%、68.05%)要比家鸽(49.97%)的高。表明毛腿沙鸡具有比家鸽和灰斑鸠更强的视觉分辨能力和对强光的适应能力,毛腿沙鸡和灰斑鸠的视神经要比家鸽的发达。Nogo C蛋白在正常状态下视网膜中的表达可能发挥某些特定的生理作用,但还需进一步研究。     

厚朴叶与厚朴皮、厚朴花的毒性比较研究

目的研究厚朴叶的毒性及与厚朴皮、厚朴花的毒性比较,为厚朴叶的开发利用提供实验依据。方法通过急性毒性实验,小鼠骨髓微核实验,小鼠精子畸形实验,大鼠30 d喂养实验,来研究厚朴叶毒性和进行毒性比较。结果在急性毒性实验中,各给药组小鼠无死亡;小鼠骨髓微核实验中和精子畸形实验中,各给药组与正常组无统计学差异。大鼠30 d喂养实验中,厚朴叶对大鼠的食物利用率、血常规、肾功能都有所影响,也影响肝、卵巢、睾丸的脏体系数;在对大鼠各脏器病理组织学检查中未见明显异常;厚朴叶与厚朴皮、厚朴花的慢性毒性差异为后两者不影响血常规。结论厚朴叶无急性毒性,无致骨髓突变毒性,无致精子畸形毒性;厚朴叶有慢性毒性作用,表现在影响食物利用率、血常规、肾功能、器官发育;厚朴叶与厚朴皮、厚朴花的毒性差异表现在慢性毒性中影响血常规,其它无差异。     

蘘荷与抗生素配伍前后对金黄色葡萄球菌抑菌效果的比较

目的为了探讨常用抗生素与蘘荷配伍后的联合抑菌效果。方法使用蘘荷、头孢拉定、左氧氟沙星、头孢曲松、青霉素和头孢呋辛为试验药物,使用金黄色葡萄球菌作为试验菌种,采用倍比稀释法和棋盘稀释法分别检测最小抑菌浓度和联合抑菌浓度指数。结果表明蘘荷、青霉素、头孢拉定、头孢曲松、头孢呋辛、左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为32 mg/mL和0.25、2、2、0.5、0.125μg/mL,蘘荷分别与头孢曲松、青霉素联用后表现为相加作用,蘘荷分别与头孢拉定、头孢呋辛联用后表现为无关作用,蘘荷与左氧氟沙星联用后表现为拮抗作用。结论表明蘘荷分别与头孢曲松、青霉素联用可以达到高效抑制金黄色葡萄的作用,对蘘荷临床应用具有参考意义。     

魔芋内生细菌抗软腐病菌株筛选

通过组织分离法从魔芋块茎中分离得到内生细菌,用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用,以筛选拮抗软腐病菌能力强的菌株。结果显示从魔芋块茎中分离得到35株内生细菌,35株内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性,不同菌株间拮抗活性存在显著差异。初筛中,对软腐病菌相对抑制率(RIR)达到50%以上的内生细菌有17株,100%的有11株。复筛中RIR为100%的内生细菌有8株,其中7株胞外产物的RIR超过了150%。     

黄芩中黄芩新素提取制备工艺优化的研究

目的 为建立制备大量高纯度黄芩新素的方法。方法 比较了超声法和回流提取法提取黄芩中黄芩新素,及不同萃取溶剂对黄芩中黄芩新素得率的影响,通过HPLC色谱法测定黄芩新素的含量,并用LC-8A高压制备色谱仪制备黄芩新素。结果 采用回流提取法及使用乙醚作为萃取溶剂时,黄芩新素得率最高,制备的黄芩新素纯度可达到97.96%。结论 本实验建立的方法操作简便,重现性好,制备的黄芩新素纯度符合对照品纯度的要求。     

基于化学计量学黄花白及和小白及HPLC指纹图谱分析

采用高效液相色谱（HPLC）法建立6批黄花白及和8批小白及指纹图谱并比较Militarine含量,利用相似度（SA）、聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）对黄花白及和小白及进行综合评价。结果显示HPLC指纹图谱共生成26个共有峰,利用对照品指认12号色谱峰为Militarine,且其含量在二者之间具显著性差异（P<0.01）;SA分析显示黄花白及和小白及相似度大于0.912,具较高的相似性;HCA和PCA将黄花白及和小白及分为两类,表明两者存在一定的差异性,分析结果相互验证。结果表明黄花白及和小白及化学组成类似,HPLC指纹图谱技术结合化学计量学方法适用于两者的区分和内在质量评价。     

艾草抑菌抗炎作用研究

研究艾草（Artemisia argyi）水煎液的抑菌抗炎作用。用试管二倍稀释法和牛津杯法测定艾草水煎液的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）、最低杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）和抑菌直径；用乙酸致小白鼠毛细血管通透试验、二甲苯致小白鼠耳肿胀试验及小白鼠棉球肉芽肿增生试验测定艾草抗炎效果。结果表明艾草具有一定的抑菌抗炎作用，艾草对大肠杆菌的MIC和MBC分别为0.125和0.25 g/mL；艾草水煎液（1.0 g/L）对大肠杆菌的抑菌圈直径为16.622 mm，为高度敏感。艾草高、中、低浓度组对小白鼠毛细血管通透性增高的抑制率分别是29.107%、27.143%和16.607%；艾草高、中、低浓度组对小白鼠耳肿胀抑制率分别是25.045%、21.779%和5.082%；艾草高、中、低浓度组对小白鼠肉芽肿增生抑制率分别是19.990%、9.101%和2.611%。这表明艾草具有一定的抑菌抗炎作用，且抑菌抗炎作用在有限范围内随药物浓度增加而增加。     

兰香草的显微鉴定

目的对马鞭草科莸属植物兰香草的显微特征进行研究。方法采用石蜡切片、表皮制片、解离组织片对药材的茎、叶横切面组织结构进行研究,粉末制片对全草粉末进行显微鉴定。结果茎横切面可见表皮被有多数非腺毛及腺毛,木质部及髓部宽广。叶横切面中主脉维管束1~3个,上表皮下厚角组织不明显,韧皮部细胞较小排列紧密。粉末中可见叶上下表皮细胞垂周壁弯曲,气孔不定式,同时可见黏液细胞、非腺毛、腺毛、导管等。结论上述显微特征可作为兰香草的显微鉴定依据。