基于适配体的胶体金色谱层析试纸条快速检测肌酸激酶同工酶

研究基于适配体的胶体金色谱层析试纸条快速检测肌酸激酶同工酶,用于揭示长期飞行下航天员潜在的心肌和肌肉损伤.利用SELEX方法筛选得到的肌酸激酶同工酶适配体,并优选出与肌酸激酶同工酶有较强亲和能力的核酸适配体应用于胶体金免疫层析试纸条,通过优化胶体金颗粒大小、缓冲液浓度等条件,成功建立了一种基于适配体的胶体金试纸法用于CK-MB的快速检测.实验结果表明,通过基于磁珠的核酸适配体筛选方法筛选出的与肌酸激酶同工酶有亲和力的核酸适配体,能够用于构建适配体-适配体夹心胶体金免疫层析试纸条并成功应用于82 nM以上的肌酸激酶同工酶的快速、可视化检测,同时,该免疫层析试纸条具有良好的特异性和稳定性,可用于未来空间医学即时检测.     

结合适配体技术的磁性粒子表面蛋白分子印迹材料研制

本文将具有高度特异性的生物分子核酸适配体引入分子印迹技术,并结合磁性纳米粒子材料比表面积大、操作简便性和易于修饰性于一体,制备出了新型蛋白分子印迹材料.首先获得性能更好的硅烷化的磁性微球,之后加入功能单体、交联剂和衍生化适配体,以溶菌酶为模板分子,制备出磁性溶菌酶蛋白分子印迹适配体-纳米粒子.实验结果显示,不同材料的蛋白吸附能力顺序由高到低分别为结合适配体的蛋白印迹材料,结合适配体的非蛋白印记材料,蛋白印迹材料和无适配体的非蛋白分子印记材料.初步研究表明,适配体与磁性粒子的结合可以有效提高蛋白质分子印迹材料的印迹效果.     

水生生物病原核酸适配体研究进展

核酸适配体(Aptamer)是指利用指数富集配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到的能特异性识别和结合靶标的ssDNA或RNA分子,具有高亲和力和高特异性的特点,在快速检测和靶向治疗方面应用广阔。近年来,水生生物细菌和病毒性病原疾病的频繁暴发,严重制约了水生态的健康以及水产养殖业的迅速发展。核酸适配体作为一种新型的识别分子,在水生生物病原的应用上也已取得了一些进展。本文对水生生物细菌和病毒性病原核酸适配体的筛选,及其在检测和治疗领域的研究现状进行综述,并对该领域核酸适配体技术的应用方向进行展望。     

基于氧化石墨烯的磺胺嘧啶核酸适配体的筛选与鉴定

[目的]利用GO-SELEX方法对磺胺嘧啶(Sulfadiazine)核酸适配体进行筛选与鉴定.[方法]基于氧化石墨烯(Graphene oxide)与ssDNA的π-π堆积作用,将氧化石墨烯作为结合ssDNA与分离的介质,以磺胺嘧啶为靶标分子,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)和磁分离技术建立了基于氧化石墨烯的核酸适配体筛选方法GO-SELEX,对筛选产物测序所得的核酸序列进行了同源性分析和二级结构预测,亲和力和特异性分析以及方法学考察.[结果]经过9轮筛选,获得了对磺胺嘧啶具有较高亲和力(Kd = 411 nmol·L-1)的核酸适配体Ap-41,且Ap-41对磺胺嘧啶的特异性良好;磺胺嘧啶质量浓度在1.0～40μg·mL-1范围内与荧光强度的线性关系良好,检出限为0.029 μg·mL-1,水样中加标回收率范围为95.0％～104.0％,相对标准偏差不超过6.1％.[结论]基于核酸适配体Ap-41的检测方法灵敏度较高,可用于后续传感器的构建及实际样品中磺胺嘧啶的检测.     

人骨肉瘤细胞适配体的早期筛选

目的体外随机合成单链寡核苷酸备选文库,以骨肉瘤U-2 OS完整细胞作为靶点,筛选出与其结合的高特异性、高亲和性单链DNA(ss DNA).方法将体外合成随机碱基序列的单链DNA文库与人骨肉瘤U-2 OS细胞相结合,收获与靶细胞结合的单链DNA,通过优化PCR条件进行大量扩增后,应用生物素-链霉亲和素亲和层析柱分离出正链DNA.结果以10,14以及18个循环时扩增ds DNA产物最理想;应用生物素-链霉亲和素磁珠分离法制备的正链ss DNA纯度高,可有效保证次级文库的筛选.结论应用Cell-SELEX技术可成功筛选早期ss DNA文库,为后续获得针对人骨肉瘤U-2 OS细胞的高特异性适配体奠定实验基础.     

特异性检测卵形鲳鲹源哈维氏弧菌的核酸适配体的筛选与鉴定

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物常见的主要致病菌之一,严重危害着我国华南沿海地区水产养殖业的健康可持续发展。针对哈维氏弧菌的快速检测诊断技术和抑菌技术等方面进行系统研究,并开发具有市场发展潜力的快速检测试剂盒和抗菌功能产品,对控制哈维氏弧菌的危害极其重要。为此,本研究以哈维氏弧菌为靶标,利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术,筛选特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体,并对核酸适配体的性质进行系统性研究。结果显示,核酸适配体H10、H13能高特异性和高亲和性地识别哈维氏弧菌,并且无毒副作用。同时,靶标性质分析表明核酸适配体(H10,H13)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。本研究运用SELEX技术筛选获得的ssDNA核酸适配体H10和H13,具有高特异性和亲和性,可用于研发操作便捷、灵敏度高的哈维氏弧菌快速检测技术。     

基于细胞－细胞融合的HIV进入抑制剂非感染性筛选方法的研究

目的:建立一个基于细胞-细胞融合的HIV进入抑制剂非感染性筛选方法.方法:将稳定表达HIV包膜蛋白gp160的效应细胞与含有或稳定表达HIV受体和辅助受体的靶细胞混合,观察合胞体的形成.用特异性的HIV进入抑制剂对检测方法进行验证.结果:本研究比较了2种效应细胞与5种靶细胞的10种组合,发现将CHO-WT和MT-2细胞混合,可形成明显的合胞体.进一步发现特异性的HIV进入抑制剂能够抑制合胞体的形成,且具有剂量依赖性.结论:这一方法能特异性地筛选作用在HIV进入阶段的抗HIV药物,操作简单方便,且无感染性,可望发展成为一个无感染性的多靶点高内涵药物筛选模型,用于天然和合成来源的小分子HIV进入抑制剂的筛选.     

CdTe量子点—钌配合物—DNA适配体探针检测血小板衍生生长因子

血小板衍生生长因子(PDGF-BB)是一种可用于肿瘤早期诊疗的肿瘤标志物,有必要发展新的方法用于PDGF的高灵敏、高选择性检测.本文采用基于巯基丙酸(MPA)修饰的CdTe量子点和钌配合物的适配体探针,建立了一种荧光检测PDGF-BB的方法.在优化条件下,利用适配体与PDGF-BB的特异性结合,该探针可实现对PDGF-BB的荧光检测.探针荧光强度与PDGF-BB浓度的线性范围为6～20 nmol/L,检测限为1.26 nmol/L.该方法为量子点—钌配合物—适配体复合体系用于生物活性分子的定量检测提供了新途径.     

基于金纳米作用适配体荧光探针的研究进展

适配体是一类能与相应配体进行特异性结合的寡核苷酸序列,对靶分子具有高度亲和力和专一性的识别能力。作为新型的功能分子,它在化学领域、生命科学以及生物医学领域发展迅速,并展示了良好的应用前景。简要综述了基于金纳米作用适配体荧光探针的研究进展。     

从噬菌体展示七肽肽库筛选α-淀粉酶特异性配体

为了建立蛋白质亲和配基的高效筛选方法，以淀粉酶为靶分子，利用交替洗脱法从七肽噬茵体展示库中筛选具有高亲和力的噬茵体配体．结果表明，交替洗脱法筛选出的特异性配体的回收率和ELISA信号值均优于酸洗脱法；采用交替洗脱法能够更加有效和迅速地筛选到淀粉酶的高亲和力配体．分析筛选得到的不同噬茵体克隆DNA插入片断的氨基酸序列，发现了可能与配体高亲和性有关的氨基酸残基．     

农药分子核酸适体筛选研究进展及其在生物传感器中的应用

核酸适体作为一类通过体外筛选指数富集配体系统进化技术(SELEX)得到的单链DNA或RNA,具有特异性强、稳定性好和靶分子广等特点,被广泛用于生化传感检测领域.总结了近年来筛选的农药分子核酸适体及其筛选方法,综述了农药分子核酸适体在生物传感检测中的应用,并探讨了农药分子核酸适体筛选的问题和未来发展的趋势.     

基于核酸适配体的荧光分析法定量检测MUC1粘蛋白

MUC1粘蛋白是一种高糖化、高分子量的糖蛋白,其在乳腺癌细胞中高度异常表达,其特异性高于组织多肽抗原,敏感性高于癌胚抗原,因此MUC1在乳腺癌诊断中具有很高的临床应用价值,而建立高灵敏的MUC1蛋白定量检测方法对临床诊断具有重要的意义.该研究建立了基于核酸适配体-滚环扩增（RCA）和氧化石墨烯-荧光共振能量转移（GO-FRET）技术的MUC1黏蛋白定量检测技术,实现了MUC1粘蛋白准确、灵敏的定量检测.结果表明,该方法定量检测线性范围为50~1 000 pg/mL,检测限为28.05 pg/mL,定量限为45.57 pg/mL,在人血样品中的回收率为96%~104%.     

运用SELEX技术筛选嗜水气单胞菌适配子

以嗜水气单胞菌为研究对象,采用适体筛选技术(SELEX,system evolution of ligands by expo-nential enrichment),利用体外合成的长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,以嗜水气单胞菌为靶目标进行12轮的筛选,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力.研究结果表明:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与嗜水气单胞菌结合后显色,A(absorbance)值逐渐增加,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72.研究已初步筛选到与嗜水气单胞菌具有高亲和力的DNA适配子,为嗜水气单胞菌的二级结构研究及其检测试剂盒的研发提供了基础.     

基于核酸适配体吸附检测技术的卵形鲳鲹源溶藻弧菌的快速检测

溶藻弧菌是引起广西等华南沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁着华南地区水产养殖业的健康可持续发展。着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的水产致病菌快速检测技术,对于及早发现、确定病原,进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失意义重大。在先前研究中,我们基于指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology,SELEX)筛选获得特异性识别卵形鲳鲹源溶藻弧菌的核酸适配体,本研究中我们基于核酸适配体VA8开展溶藻弧菌的快速检测诊断技术的研究,开发出一种新型的能够快速检测溶藻弧菌的核酸适配体吸附检测技术(Aptamer VA8-based enzyme-linked aptasorbent assay,VA8-ELASA),并对VA8-ELASA技术检测溶藻弧菌的特异性和灵敏性进行分析研究。VA8-ELASA技术可以用于溶藻弧菌的快速检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。本研究基于核酸适配体VA8建立的新型核酸适配体吸附技术(VA8-ELASA),有望实现对广西卵形鲳鲹养殖中溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

适配体修饰的纳米金比色法检测牛奶中的三聚氰胺

以三聚氰胺作为检测目标,设计合成了能与三聚氰胺特异性结合的适配体,选取表面活性剂邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA),将纳米金比色法与适配体的分子识别相结合,确立了一种简单、高效、快速检测三聚氰胺的新方法.在三甲基硅丙磺酸(pH 7.0)缓冲溶液条件下,此反应体系的最佳条件为25nmol/L适配体,0.44nmol/L PDDA,反应时间为20min,通过可见光吸收光谱可检测的检测下限为34nmol/L.在牛奶样品的检测中,三聚氰胺的加标回收率为90%~120%,可以满足牛奶样品中三聚氰胺残留的精确检测要求.     

基于新型核酸适配体-荧光分子检测探针的石斑鱼虹彩病毒病快速诊断

【目的】石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是引起华南沿海地区重要海水养殖鱼类石斑鱼(Epinephelus tauvina)发生病毒性鱼病的主要病毒性病原之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁华南地区石斑鱼养殖业的健康可持续发展。着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的SGIV快速检测技术,对于及早发现、确定病原,进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。【方法】基于核酸适配体(Q2)就SGIV病的快速检测诊断技术进行系统研究,开发出一种新型的核酸适配体-荧光分子检测探针(Aptamer Q2-based fluorescent molecular probe,Q2-AFMP),并对Q2-AFMP检测SGIV感染的特异性、灵敏性和稳定性进行分析。【结果】Q2-AFMP可以特异性检测SGIV感染,且其灵敏性和稳定性均比较高。【结论】本研究中基于核酸适配体构建的新型高特异性荧光分子探针(Q2-AFMP)有望实现对海水养殖中石斑鱼虹彩病毒病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

大肠杆菌核酸适配体筛选的研究

由于传统微生物检测存在步骤繁琐、耗费时间、成本较高等缺点,因此研发快速有效检测微生物的新技术新方法显得尤为必要.本文利用whole-cell SELEX技术,进行了大肠杆菌活细胞核酸适配体的筛选,对单链DNA的制备鉴定、每轮筛选核酸文库的检测、核酸适配体的扩增克隆等内容进行了研究,在筛选过程中成功制备了单链DNA,并对整个筛选过程的核酸适配体库进行监测,保证了筛选的顺利进行,并对核酸适配体库进行了扩增和克隆,最终获得靶向大肠杆菌的核酸适配体序列,这将有助于基于核酸适配体的微生物检测新方法的建立.     

高通量筛选高特异性的检测类风湿关节炎的生物探针分子

从靶蛋白-配体特异性结合角度,采用蛋白折叠码(PFSC)技术在PDB数据库中高通量地筛选出与TNFA_HUMAN靶点区结合灵敏度高的分子作为检测类风湿关节炎的生物探针分子.结果显示,小分子307具有相对较高的灵敏度和较低的检出限,可以作为生物探针来检测类风湿关节炎.结果显示,蛋白指纹检索技术是一种快速、有效的蛋白质结构检索工具,通过对数据库中海量数据的筛选,可为重大疾病的检测试剂开发提供先导信息.     

免疫磁珠检测食品中金黄色葡萄球菌的研究

通过对金黄色葡萄球菌免疫磁珠添加量、免疫磁珠与菌液最佳反应时间、免疫磁珠分离金黄色葡萄球菌的敏感性试验、特异性试验的研究,确定了金黄色葡萄球菌抗体添加量50μg/m L、免疫磁珠添加量100μL,免疫磁珠与菌液最佳作用时间为30 min,免疫磁珠法检测灵敏度底限为10-9,相应的细菌浓度为14 cfu/m L.本试验制备的免疫磁珠灵敏性强,特异性高,大大节省了检测时间和费用.因此研究食品中金黄色葡萄球菌快速、准确检测方法以预防和控制食品安全事件的发生,具有重要的现实意义.     

无标电化学免疫传感器灵敏检测17β-雌二醇

在羧基化氧化石墨烯及纳米金的辅助下根据抗原和抗体之间的特异性结合,检测17β-雌二醇.通过在金电极上修饰一层羧基化氧化石墨烯-硫堇,再修饰一层纳米金,其后修饰一层抗体,待纳米金和抗体充分结合后修饰抗原.通过构建的电化学免疫传感器测出各层次的循环伏安(CV)曲线从而实现对17β-雌二醇的定量检测.在实验优化的条件下,用得到的17β-雌二醇曲线进行检测和处理,结果显示,构建的传感器对17β-雌二醇具有较宽的线性范围:0.3-3μg/mL,以及较低的检测限:50pg/mL.因此,基于氧化石墨烯的无标电化学免疫传感器能够克服现有传统方法高耗时、高花费、仪器昂贵等缺点,实现简单、快速、便宜、高灵敏和高特异性的定量检测实际样品中的17β-雌二醇.具有较好的实际应用价值.