杂色鲍♀×盘鲍♂合杂交受精的细胞学研究

应用组织学方法。研究了杂色鲍♀×盘鲍♂舍种间杂交受精过程的核相变化。结果表明杂色鲍♀×盘鲍♂种间杂交受精主要表现出两性融合的特点．盘鲍精子进入杂色鲍卵子。9min后中心粒发育为星光；精子头部逐渐膨大、液化形成雄性原核，39min后与雌性原核会合，而后融合．约3．2％的受精卵中观察到1个受精卵中同时存在3个即将融合的原核，这可能是多精入卵或卵子染色体组自发加倍的结果．42min后开始第1次有丝分裂。此时在极个别发育卵中发现固缩的染色质小体、微核、或分离不同步的染色体．     

鲍体表黏液的几种免疫酶比活力的比较

为探索鲍体表黏液的免疫机制,利用生化测定的方法对杂色鲍(Haliotis diversicolor)、皱纹盘鲍(Haliotis dis-cus)、西氏鲍(Haliotis sieboldii Reeve)及杂色鲍不同杂交群体鲍体表黏液中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)的比活力进行了测定,并比较了它们之间的差异.结果表明在3种不同鲍中,西氏鲍体表黏液中AKP、T-SOD的比活力最强,显著高于杂色鲍台湾群体,这与生产实践中西氏鲍抗逆性强、存活量高相吻合,推测AKP、T-SOD是较好的免疫指标性酶;而在杂色鲍不同的杂交群体间,台湾♀×F1♂杂交群体与F1♀×台湾♂杂交群体体表黏液中3种酶比活力均最高,推测这种杂交方式能够产生较强的杂种优势.本研究有助于为鲍的选育和病害的防治提供参考.     

西氏鲍与盘鲍杂交育苗的初步研究

于2005年11月～12月利用从日本引进的西氏鲍与盘鲍进行了杂交育苗实验,获得西氏鲍♀×盘鲍♂、盘鲍♀×西氏鲍♂、西氏鲍♀×西氏鲍♂和盘鲍♀×盘鲍♂4个组合的F1代.对西氏鲍和盘鲍的卵径以及4个组合的受精率、孵化率、胚胎发育速度、子代早期阶段的生长速度以及存活率进行比较,结果表明:西氏鲍和盘鲍的卵黄径并无明显差异,而二者的卵膜径差异显著.西氏鲍♀×盘鲍♂的受精率为19.1%～65.3%,孵化率为76.3%～84.8%.盘鲍♀×西氏鲍♂的受精率为22.3%～82.7%,孵化率为77.1%～85.2%.在水温19.0℃、盐度30的条件下,杂交组合比自繁组合的胚胎发育速度明显滞后.在鲍苗生长的早期阶段(12、20、30、60 d),各组合生长速度差异不显著(p＞0.05),但从100 d后,杂交子代的生长速度快于盘鲍和西氏鲍的自繁子代,其中以西氏鲍♀×盘鲍♂的生长速度最快,与其它组合相比差异显著(p＜0.05),表现出一定的杂种优势.但是,在180 d内,杂交组合和自繁组合稚鲍的存活率差异不显著(p＞0.05).     

斑马鱼受精过程中原核的时空规律

斑马鱼的成熟卵子处于第2次减数分裂中期,精子通过受精孔进入卵内,精子入卵后,卵子被激活;受精后3 min,精核位于卵质膜内侧边缘,处于凝集状态;受精后5 min精核开始解凝;受精后8 min,精核明显解凝,受精卵出现明显的精子星光.同时进入第2次减数分裂后期,之后排出第二极体;受精后10 min,雄原核形成,具有双星光,此时,雄原核已位于胚盘中部;受精后15 min雌原核已形成,雌、雄原核向胚盘中央靠近;受精后20 min,雌雄原核开始接触;受精后30 min,雌雄原核完全融合成为1个合子核;35 min时,受精卵开始第1次卵裂;45 min后分裂形成2个子核;50 min时分裂为2细胞,60 min时分裂为4细胞.     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)与黑足鲍(Haliotis iris)杂交育苗的初步研究

采用新的性腺发育控制技术和温控转换受精技术,对皱纹盘鲍与黑足鲍进行了杂交和自交育苗比较研究.结果表明,皱纹盘鲍♀×黑足鲍6的杂交受精率和孵化率分别为23.4％和32.87％,皱纹盘鲍自交受精率和孵化率分别为77.97％和76.86％,二者附着率和变态率相近;在水温20℃,盐度3.0％的条件下,杂交鲍胚胎发育速度明显比自交鲍滞后,但生长速度明显高于皱纹盘鲍,体现出较好的杂交优势.     

杂色鲍日本群体与台湾群体杂交的初步研究

采用杂色鲍日本群体(RB)和台湾群体(TW)进行群体间杂交及群体内自繁,得到RB♀×TW♂、TW♀×RB♂、TW♀×TW♂和RB♀×RB♂4个组合的F1代.对这些交配组合的卵径、受精率、胚胎发育速度、幼体附着率、幼体变态率、幼体存活率以及稚贝早期生长进行了比较.结果表明,杂交组与自繁组在卵径、受精率以及胚胎发育速度方面并无显著的差别,但杂交组在幼体附着率、幼体变态率、幼体存活率以及稚贝早期生长方面,与自繁组相比表现出不同程度的杂种优势.TW♀×RB♂组8 d的存活率杂种优势达到40.6%,RB♀×TW♂组25 d壳长的杂种优势达到48.6%.实验初步显示,不同地理群体间的杂交将可能是养殖杂色鲍遗传改良的有效途径.     

细胞松弛素B诱导鲍异源三倍体

用细胞松弛素B(CB)处理受精卵(九孔鲍♀×盘鲍♂),抑制第二极体释放,诱导异源三倍体.在水温24℃下,分别进行了不同起始处理时间(受精后5~25 min)、不同药物处理浓度(0.2~1.0 mg/L)和不同持续处理时间(5~15 min)的实验.结果表明:受精后10~15 min开始处理的效果较好,平均担轮幼虫成活率为52.07%,平均三倍体率为55.81%;最佳药物处理质量浓度为0.4 mg/L,最佳持续处理时间为10 min,担轮幼虫率为21.43%,异源三倍体率为50.96%;药物空白对照组1(九孔鲍♀×九孔鲍♂)担轮幼虫率为85.38%,二倍体率为95.42%;药物空白对照组2(九孔鲍♀×盘鲍♂)担轮幼虫率为54.37%,二倍体率为75.87%.综合考虑,鲍异源三倍体的适宜诱导条件为:在受精后13 min,即当40%~50%受精卵排出第一极体时,用0.4 mg/L的CB处理10 min.     

弓獭蛤受精及早期卵裂过程核相变化的细胞学观察

采用Hoechst 33258染色和荧光显微镜技术,对弓獭蛤(Lutraria arcuata)受精和早期卵裂过程中的核相变化进行观察.其成熟未受精卵呈圆球形,卵径55~60μm,核相处于第1次成熟分裂前期;精子为鞭毛型,全长约50~55μm.精卵混合后,精子迅速附着于卵子表面;受精后10~30 min,精子入卵膨胀成球形;30~50 min进行第1次成熟分裂,排出第1极体;50~60 min进行第2次成熟分裂,排出第2极体;同时精核和卵核体积膨胀,形成雄原核和雌原核;70 min左右,雌、雄原核联合,形成第1次有丝分裂的中期分裂相;70~90 min受精卵进行第1次卵裂,形成2个卵裂球;90~110 min进行第2次卵裂,形成1大3小的4个卵裂球.     

人工诱导盘鲍异源雌核发育多倍体的初步研究

通过预实验,观察和了解在24.8℃下九孔鲍精子与盘鲍卵子授精,及其受精卵第一极体和第二极体出现的时间.采用不同浓度的乙烯脲失活九孔鲍精子的遗传物质,确定其最佳处理浓度和处理时间.遗传物质失活的九孔鲍精子和盘鲍卵子授精,用CB进行不同持续处理时间抑制受精卵第一极体和第二极体出现的方法诱导多倍体.实验结果表明,在水温24.8℃下,作为失活九孔鲍精子遗传物质的乙烯脲,当其质量分数为0.5‰和处理时间为10 min是比较适宜的;用遗传物质失活的九孔鲍精子与盘鲍卵子授精,在授精后10 min,用浓度为1.0 mg.dm-3的CB持续处理受精卵24 min,表观三倍体率达65%以上,表观四倍体率达5%左右.稚鲍的倍性检查中,雌核发育多倍体占总多倍体数的80%,杂交多倍体占20%.盘鲍异源雌核发育的三倍体率达到93%,四倍体率为3%左右.     

4种鲍肠道菌群多样性比较

利用16S rRNA高通量测序技术比较皱纹盘鲍、黑足鲍、黑唇鲍和杂交鲍(皱纹盘鲍♀×黑足鲍♂)菌群结构特征、多样性.结果表明,OTU数量、Shannon指数和Chao1指数均为黑足鲍最大,黑唇鲍最小;4种鲍肠道中优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和软壁菌门(Tenericutes),占比达到61.93％～95.78％.其中,皱纹盘鲍、黑足鲍和杂交鲍中绝对优势菌门为变形菌门,而黑唇鲍为软壁菌门;冷泥杆属(Psychrilyobacter)、弧菌属(Vibrio)和支原体属(Mycoplasma)为4种鲍肠道的优势菌属,占比达到39.70％～53.65％;4种鲍核心菌群共有175个OTU,相对丰度超过1％的共有11个OTU;Anosim和Adonis分析均发现杂交鲍与黑唇鲍、杂交鲍与黑足鲍、皱纹盘鲍与黑唇鲍肠道菌群存在显著性差异(P<0.05);经LefSe分析鉴定出4种鲍肠道菌群具有显著性差异的Biomarker共有7个,包括黑足鲍的6个和杂交鲍的1个.     

人工四倍体皱纹盘鲍的发生

采用化学药物进行诱导皱纹盘鲍四倍体的研究,结果表明,在受精后１０ｍｉｎ开始,用１ｍｇ／ｌ浓度的ＣＢ持续处理皱纹盘鲍受精卵３０ｍｉｎ通过阻止极体释放,可获得２１．９％的四倍体胚胎。用０．０５ｇ／Ｌ浓度的秋水仙素,在受精后４０～５０ｍｉｎ的效应时间开始处理,持续３ｍｉｎ能抑制皱纹盘鲍的第一次有丝分裂,四倍体诱导率最高为１３．０％,此外观察到,秋水仙素对染色体组加倍最为敏感的效应时间,也是胚胎对诱导处理     

鲢鱼(♀)和鲤鱼(♂)杂交的研究

本实验是应用鲤鱼♂和鲢鱼♀为材料,观察了杂交卵胚胎的发育过程和杂交鱼幼苗孵出后的变化,并做了杂交受精卵的石腊切片,用H.E染色,用光镜观察并照象。实验的结果如下: (1)实验证明鲤鱼♂和鲢鱼♀杂交卵的受精率,在三次观察中分别为74％,85％,86％,对照组受精率三次观察分别为73％,89.3％,90％。 (2)鲤♂×鲢♀杂交鱼的孵化率,二次观察计数分别为41％,51％。对照组(鲢♀×鲢♂)孵化率分别为60％,62％,74％,杂交种孵化的时间处于鲢和鲤鱼的中间类型。 (3)鲤鱼♂×鲢鱼♀杂交种鱼苗外部性状,在池塘喂养一个月后,尾鳍条是红的似鲤鱼性状,头部及躯体似鲢鱼,待鱼苗在池塘培育二个月后,完全似鲢鱼性状。 (4)鲤鱼♂×鲢鱼♀杂交后,鱼卵胚胎发育不规则。孵化出来的鱼苗有畸形,其形状为胸部膨大,尾部弯曲。     

皱纹盘鲍精子的激活及超低温保存研究

用不同浓度的氨海水激活解剖获得的皱纹盘鲍精子并进行激活率和受精率的测定.以自然海水作基础溶液,以二甲基亚砜(DMSO)和甘油(Gly)做保护剂,在不同降温程序下,将解剖获得和经诱导自然排放的皱纹盘鲍精子置于液氮罐中保存24 h,解冻后检测精子的成活率.结果表明,加入自然海水后有64.27%的解剖精子被激活,但不能受精,经氨海水处理后的精子在0.02‰浓度条件下激活率和受精率最高,分别为85.60%、67.42%.自然排放和解剖获得的精子在14%DMSO、4℃平衡15 min,-20℃时平衡5min,-80℃时平衡5 min条件下精子存活率最高,分别为48.15%和64.01%.     

植物杂交概念的拓展——四论高等植物染色体杂交

在植物染色体杂交中,一个受体细胞的染色体和外源的染色体在胞内发生染色体杂交,使得分化中的受体细胞具有杂交染色体,从而发育出杂交植物.这和植物有性杂交中精子和卵子两个细胞结合不同,也和植物体细胞杂交中两个脱壁体细胞融合也不同,因此植物染色体杂交拓展了植物杂交的概念,即从两个相异细胞的融合杂交到一个细胞内两种不同染色体的融合杂交.     

杂交鲍染色体GISH的优化

基因组荧光原位杂交(GISH)是分析远缘杂交染色体组结构的有力工具。为了提高杂交鲍GISH的信号强度,以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)和杂色鲍(H.diversicolor)杂交子代为研究对象,研究了杂交缓冲液中探针质量浓度、封阻DNA质量浓度,以及去离子甲酰胺、硫酸葡聚糖或聚乙二醇6000的含量对GISH信号强度的影响。结果表明,杂交缓冲液中,探针质量浓度应大于6.25 ng/μL,封阻DNA(鲑精DNA)的适宜质量浓度约为探针的10倍,去离子甲酰胺的适宜体积分数约为30%,硫酸葡聚糖的适宜体积分数为12.5%～17.5%。此外,用7.5%的聚乙二醇6000替代硫酸葡聚糖可以提高杂交信号,但存在信号噪点多等问题。     

皱纹盘鲍与九孔鲍杂交的研究

采用皱纹盘鲍与九孔鲍进行杂交,并与两亲本自交进行育苗比较.结果表明:自交组的受精率、孵化率以及存活率显著高于杂交组(P0.05);皱纹盘鲍(♀)×九孔鲍(♂)和皱纹盘鲍(♂)×九孔鲍(♀)杂交的受精率分别为0.9%和3.2%,受精率存在显著差异(P0.05),而孵化率分别为12.4%和13.1%,二者差异不显著(P0.05),二者之间幼体存活率的差异也不显著(P0.05);自交组和杂交组之间的鲍生长速度存在明显的差异(P0.05),杂交组合的生长速度明显比自交组合的要快;但杂交组中稚鲍的存活率和自交组之间差异不显著(P0.05).     

锯缘青蟹受精过程核相变化的研究

用光镜和组织切片技术研究了锯缘青蟹受精过程核相变化的特征．锯缘青蟹刚排出的成熟卵子为初级卵母细胞．核相处于第1次成熟分裂的中期．在卵子产出后30min内第1极体排出并分裂成两个小极体;第2极体随着受精膜的形成和举起而排放。在卵子产出后50～60min内排出;第1．2极体分别位于受精膜的内外两侧．雄性原核形成早于雌性原核;雌雄原核形成后向卵子中央移动。最后发生联合形成联合核．排卵后的6～7h内。合子核才开始第1次核分裂．锯缘青蟹为数精人卵．单精受精．     

近江牡蛎受精细胞学研究

用醋酸－地衣红染色的方法对近江牡蛎人工授精的卵子减数分裂和受精过程进行了详细细胞学观察。精子入卵前，卵子处于第一次减数分裂的前期（胚泡期），精子入卵后，胚泡消失，然后进行两次减数分裂，在海水温度为２８．８℃的情况下，授精后３３ｍｉｎ和４５ｍｉｎ，绝大部分受精卵已排出第一极体和第二极体，雄原核可在第一极体排出后及第二极体排出前任何时期内形成，雌雄原核以联合的方式将两组染色体合并，授精后１ｈ，大部分卵     

黄姑鱼♀与大黄鱼♂杂交试验与AFLP分析

开展了黄姑鱼♀与大黄鱼♂杂交试验,并对杂交F1初孵仔鱼进行了AFLP分析.黄姑鱼♀与大黄鱼♂杂交能够正常受精,杂交受精率为93.54%,受精卵正常发育、孵化,孵化率为86.23%,但仔鱼在开口后一周内全部死亡.利用8对选择性扩增引物组合对亲本和杂交后代（家系）初孵仔鱼进行AFLP分析,共得到456个条带,其中母本特异条带（Female Special Band,FSB）178条、父本特异条带（Male Special Band,MSB）187条、双亲共有条带（Mutual Band,MuB）91条.且其中84条（47.2%）FSB、89条（47.6%）MSB和75条（82.4%）MuB为全部杂交仔鱼共有,其余94条（52.8%）FSB、98条（52.4%）MSB和16条（17.6%）MuB在杂交后代中发生了分离.分离的FSB和MSB中分别有33.0%和28.6%表现为偏分离.AFLP分析结果表明,黄姑鱼♀与大黄鱼♂杂交的初孵仔鱼含有双亲的条带,是真正的杂交种,是构建大黄鱼与黄姑鱼遗传图谱以及研究杂种在细胞和分子水平隔离机制的适合材料.     

试述鲍类前合子生殖隔离

生殖隔离是一个最重要的生物过程。虽然有许多机理还是未知的,但已研究清楚了物种之间的生殖隔离有两种方式。即通过配子不成熟、不受精的前合子生殖隔离和杂交后代的不育、不成活的后合子生殖隔离。在动物受精过程中,两个配子的质膜在接触融合之前,精子必须穿透包绕在卵细胞外的物质,为完成这一过程,大多数种类的动物都发展了精子结构,使其带有顶体泡,它通过泡吐作用释放具有溶解作用的蛋白质,由它担任穿透卵细胞外被的作用。成熟的鲍精子具有发达的顶体泡,里面含有多种蛋白质,但其中的两种蛋白质－细胞溶素（16kDa）和18kDa蛋白质与生殖有关,是生殖隔离的主要分子结构。当精子粘附到卵黄外膜上时就诱发了顶体反应,释放的16kDa蛋白质利用非酶解反应,在卵黄膜上穿一个小孔,精细胞便从此处穿过卵黄膜与卵细胞融合。鲍类的卵细胞由一层又厚又复杂的细胞外基质包被,并由胶状物、卵黄膜和细胞表面壳等几种成分组成。超微结构研究发现：胶状物位于卵细胞的最外层,由疏松排列的纤维组成,它在鲍类受精中的作用还没有研究不禁。鲍类的ESC层与海胆的卵黄膜十分相似,含有精子结合受体,它是不分支的糖蛋白,同同细胞溶素结合的惟一成分,它具有种属特异性。每个受体大约同60个细胞溶素结合。所以种间受精的抑制因素也许并不只有卵黄膜与溶解蛋白的反应,还可能有精子对ESC层的粘接作用。