木瓜SOD的提取及其活性测定方法的优化

目的 建立能准确测定木瓜超氧化物岐化酶(SOD)活性的测定方法。方法 采用单因素试验分析法,通过探究邻苯三酚自氧化反应体系的最大吸收波长、测定时间段、缓冲液pH值、邻苯三酚浓度和反应温度对自氧化速率的影响,建立了测定木瓜SOD活性的邻苯三酚自氧化法最佳应用体系;通过建立的木瓜SOD活性检测方法优化木瓜SOD提取条件。结果 邻苯三酚自氧化法最佳测定条件为:检测波长319nm,测定时间范围3.5min,缓冲液pH8.20,反应温度25℃,邻苯三酚浓度4.5mmol/L。木瓜SOD最佳提取工艺为:pH6.8的磷酸盐缓冲液、超声功率600W、超声时间20min浸提木瓜SOD,丙酮分级沉淀法纯化木瓜中的SOD,最终所得SOD用邻苯三酚自氧化法测定活性为529.72U/mg。结论 建立了能准确测定木瓜SOD活性的检测方法,并筛选得到木瓜最佳SOD提取条件。     

邻苯三酚自氧化法在SOD活性测定中的应用

为了验证邻苯三酚自氧化法的准确性和实用性,对邻苯三酚在Tris-HCl和磷酸盐2种不同反应体系(缓冲液)中的自氧化产物进行UV-Vis吸收光谱扫描,确定其最适吸收峰;同时研究了tcv Cu,ZnSOD(简称tcvSOD)和Bovine Cu,Zn-SOD(简称Bovine SOD)分别在2种缓冲液中对邻苯三酚自氧化反应的抑制模式.波长扫描显示,终浓度为0.225mmol/L的邻苯三酚在50mmol/L Tris-HCl pH 8.2缓冲液中于320nm处30s出现明显吸收峰,30min吸收峰达到最高值;30min后440nm附近出现吸收峰;A320处的自氧化速率为0.139/min.同样浓度邻苯三酚在0.2 mol/L pH8.0磷酸缓冲液中除了A320的自氧化速率稍高(A3200.152/min)外,其他性质与50mmol/L Tris-HCl相同.tcvSOD和Bovine SOD在Tris-HCl缓冲液中对邻苯三酚自氧化反应的抑制作用较磷酸盐缓冲液为强.研究结果确认320nm可作为检测邻苯三酚自氧化、SOD对其产生抑制及SOD活性间接测定的特定波长.     

四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较

邻苯三酚自氧化法(420nm法)与邻苯三酚/DTT终止法测定SOD酶活力,结果基本一致,其转换系数(CC)为1.03;改进的邻苯三酚自氧化法(325nm法)、微量邻苯三酚/Vc终止法测定SOD酶活力与420nm法差别较大,其转换系数分别为2.51、5.51.在测定SOD酶活力时,可根据不同的测定方法采用转换系数进行校正;实验表明:终止剂维生素C(Vc)和二硫苏糖醇(DTT)对SOD酶活力的测定无影响;325nm法与Vc法灵敏度较高,可用于SOD活力较低的样品.     

银杏叶超氧化物歧化酶(SOD)活性研究

对超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法的影响因素,如缓冲溶液组成和浓度、pH值、EDTA用量等因素进行了系统研究,通过比较邻苯三酚自氧化反应速率、线性回归方程的线性相关性和线性区间筛选出最佳条件,并根据优化的实验条件对银杏叶SOD提取液进行了活性研究.     

邻苯三酚自氧化法适于测定SOD活性吗?

用邻苯三酚自氧化法测定了Cu-ZnSOD(Superoxide dismutase，SOD）及根据天然超氧化物歧化酶活性部位结构设计、合成的一些模型化合物（the models of SOD，MSOD）活性。测试结果表明：Cu-ZnSOD和含Cu（Ⅱ）、Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅱ、Ⅲ的SOD模型化合物随浓度升高，有的对邻苯三酚氧化表现为负抑制（即促进邻苯三酚氧化）；另一部分化合物在较低浓度表现为抑制，较高浓度表现为负抑制的交替变化；或抑制率的无规则变化。本文对出现负抑制的内在根源进行了探讨，鉴于邻苯三酚自氧化的复杂反应机理；含Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Mn（Ⅱ、Ⅲ）SOD模型化合物的多酚氧化酶活性和Fenton反应催化活性，及MSOD中金属离子的Lewis酸性，不宜采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。     

多种体系中黄连素和NAC抗氧化活性的研究

采用硫代巴比妥酸比色法,彗星电泳,SDS-PAGE法检测了黄连素与NAC单独或联合时对脂质过氧化、DNA损伤、蛋白质氧化降解的保护;用邻苯三酚自氧化法、甲基紫法和DMPD·+法检测了二者对超氧阴离子、羟自由基和DMPD·+自由基的清除能力.结果表明,黄连素具有良好的抗氧化效果,且呈浓度依懒性.黄连素浓度为30μmol/L时对超氧阴离子清除率达到22.01%,150μmol/L时接近100%.在与NAC联合后,作用强于二者单独作用的效果,但稍低于二者单独作用的叠加.黄连素在清除羟自由基,浓度为10μmol/L时,清除率已达到95%,联合NAC作用后,却显示了负协同效应.相比而言黄连素对DMPD·+的清除能力较弱,黄连素浓度为80μmol/L时,对DMPD·+自由基的清除率为3.6%,而NAC与黄连素联用后,清除活性远高于两者的单独加和.以上结果均呈现出黄连素显著的抗氧化活性.     

邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究

目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱,为提高测定结果的可比性,对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的方法进行了研究,就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH及所含的EDTA量等因素对测定结果的影响进行了探讨,根据实验结果,提出了新的改良方法.     

番茄红素的抗氧化活性研究

番茄红素是最主要的类胡萝卜素,且具有多种生理活性.为了促进番茄红素在医药方面的应用,通过铁氰化钾法、脱氧核糖降解法、邻苯三酚自氧化法以及硫代巴比妥酸比色法检测番茄红素的还原力,以及对羟自由基、超氧阴离子的清除作用和对脂质过氧化的抑制作用;用MTT法、SDS-PAGE法以及毛细管电泳检测番茄红素对细胞、蛋白质以及DNA氧化损伤的保护作用,用槲皮素为对照,研究番茄红素的抗氧化活性.结果表明,番茄红素具有一定的还原力和较强的自由基清除能力,对羟自由基和超氧阴离子的EC50分别为0.02和69.31μmol·L-1;抑制脂质过氧化的IC50为20.8μmol·L-1,在浓度为5μmol·L-1时对细胞、DNA的氧化损伤具有明显保护作用,且活性均比槲皮素强.表明番茄红素具有较强抗氧化活性.     

超氧化物歧化酶活性的测定

主要采用光谱法研究测定超氧化物歧化酶(SOD)活性及不同实验条件对其活性的影响,找出最优的测活条件,为实际工作提供一些有意义的指导,并且为下一步的酶促反应动力学研究提供实验和理论依据.实验结果表明,测定SOD活性的最优条件为:实验温度为25℃,0.1mol.L-1 Tris-HCl缓冲溶液,pH值为8.20,内含2.0mmol.L-1 EDTA,邻苯三酚浓度为2.5mmol.L-1,控制酶的加入量为0.30mL.     

大麦提取物体外抗氧化活性检测

用丙酮抽提了大麦的酚类成分并检测了总酚含量以及提取物对羟自由基、超氧阴离子的清除作用,测定了还原力和对大鼠肝微粒体脂质过氧化的一致活性.结果表明,大麦提取物能有效清除由Fenton反应产生的羟自由基及邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子,其活性高于Trolox;有较强的还原力和对脂质过氧化的抑制作用.结果提示大麦提取物在体外...     

超氧化物歧化酶活性肾上腺素自氧化紫外测定法

本文证实肾上腺素自氧化过程的325nm 吸收峰远比480nm 吸收峰高和稳定,并用 SOD 标准品和人红细胞样品建立了 SOD 活性肾上腺素自氧化紫外分光测定法(A_(325))。本方法简便、快速,比用480nm 的方法更为灵敏,并有良好的定量性和重复性。     

明日叶查尔酮对紫外线诱发HaCaT细胞损伤的防护作用

 为研究明日叶查尔酮（Angelica keiskei chalcones,AC）对紫外线诱发HaCaT细胞损伤的防护作用,采用紫外线照射损伤的HaCaT细胞,分别加入高、中、低剂量依次为20、10、5μmol/L终浓度的AC,共同培养24 h,采用3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide（MTT）比色法测定细胞增殖活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率,试剂盒法测定细胞MDA含量和SOD、CAT及Caspase-3的活性,逆转录聚合酶链式反应方法检测细胞BCL-2和Bax的mRNA表达水平。结果表明,与正常对照组比较,照射模型组细胞增殖活性、SOD、CAT活性、BCL-2 mRNA表达水平降低,而细胞MDA含量、凋亡率、Caspase-3活性以及Bax mRNA表达水平则升高;中、高剂量AC组细胞增殖活性、SOD、CAT活性、BCL-2mRNA表达水平均高于照射模型组,而细胞MDA含量、凋亡率、Caspase-3活性以及BaxmRNA表达水平则均低于照射模型组。上述各项差别均具有统计学意义（P<0.05）。研究发现,明日叶查尔酮可抑制紫外线照射诱发的HaCaT细胞凋亡,调节BCL-2和Bax的mRNA表达水平,增强细胞的抗氧化酶活性,减轻受损细胞的脂质过氧化水平,对紫外线照射导致的细胞损伤有良好防护作用。     

经典连苯三酚SOD测活法（420nm法）的某些影响因素

本文对超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的经典连苯三酚测活法的某些影响因素进行了考查。结果发现：固定自氧化速率，ｐＨ值改变０．１０单位将引起２０％左右的测定误差；固定连苯三酚终浓度，同样程度的ｐＨ变化仅产生约１３％的测定误差。在低浓度下（最终浓度小于０．１５ｍｍｏ１／Ｌ），连苯三酚的微小变化会严重影响活性测定结果。     

具有GPx和SOD双酶活性含硒76肽的制备及其穿膜效应

根据模块酶原理设计一种嵌有穿膜结构域序列并具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)双酶活性的含硒76肽(Se-CuZn-76P),利用半胱氨酸缺陷表达法在单一蛋白生产(SPP)系统表达该肽,并鉴定其穿膜效应.实验结果表明:该方法可成功表达纯度较高的Se-CuZn-76P,并且每毫克蛋白表现出109μmol/min的GPx活力和1 218μmol/min的SOD活力;在Se-CuZn-76P存在的环境中培养肝L02细胞一段时间后,细胞内的GPx和SOD活力分别升高1.65和4.12倍,且Se-CuZn-76P可顺利进入L02细胞.     

流动注射化学发光法测定肾上腺素

在酸性条件下,基于肾上腺素对硫酸铈与亚硫酸钠体系的化学发光反应有显著增敏作用,建立了测定肾上腺素的流动注射化学发光分析新体系.在优化的实验条件下,检出限为7.2×10-7mol/L,肾上腺素浓度在2.0×10-6至5.0×10-4mol/L范围内与化学发光强度呈良好的线性关系.对5.0×10-5mol/L肾上腺素进行了9次平行测定,其相对标准偏差为3.1%.该法成功用于医用注射液中肾上腺素的测定.     

2-羟基-1-萘甲醛缩乙二胺铜配合物的合成、表征及其生物活性的研究

合成了N,N′-双(2-羟基-1-萘甲醛)缩乙二胺配体(H_2L)及其Cu(Ⅱ)配合物,通过元素分析、红外吸收光谱、紫外吸收光谱、摩尔电导率等分析手段对其结构进行了表征,并用邻苯三酚自氧化法测定了配合物的生物活性,结果表明该配合物具有SOD活性。     

人EC-SOD的克隆及高效表达

将编码人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）成熟肽的cDNA插入含T7启动子的质粒pET-28a( )中构建表达质粒pET-EC-SOD，表达菌株用1mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达3h-5h后，产生较多的重组人EC-SOD，并形成包含体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白质的26%以上。经纯化和复性后的EC-SOD比活为每毫克纯化酶蛋白1200U。将EC-SOD转染粉纹夜蛾Tn-5Bl-4细胞，经扩增后在细胞内进行表达。SOS-PAGE分析结果表明，粉纹夜蛾细胞中表达一相对分子质量约为28ku的特异蛋白质带，Western blot分析表明，该特异条带即为EC-SOD蛋白，连苯三酚自氧化法测得表达产物比活为每毫克细胞裂解物260U。     

琐琐葡萄多糖对PC12细胞损伤的神经保护作用

 体外培养PC12细胞,采用20μmol/L β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)作用24h诱导细胞损伤,建立阿尔茨海默病(AD)细胞模型,研究琐琐葡萄多糖(VTP)对PC12细胞损伤的神经保护作用。设立对照组、模型组和VTP保护组(20,40,80μg/mL),CCK-8法检测各组细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞膜通透性及完整性,化学比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,20,40,80μg/mL VTP可提高PC12细胞存活率,减少LDH渗漏,增加SOD活力,减少MDA含量,降低细胞凋亡率,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。由此推论,VTP对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和氧化损伤具有明显的保护作用。     

Cytochrome P450 Monooxygenase Immobilization as a Model of Herbicide Metabolism in vitro

To investigate herbicide metabolism in vitro by cytochrome P450 with stable enzymatic activity, cy-tochrome P450 is immobilized in silk fibroin. The enzymatic activity of immobilized cytochrome P450 is maintained above 80% after repeated batch experiments for 10 times. Moreover, the enzymatic activity of immobilized cytochrome P450 is kept as relatively high as 73.8% after storage for two months at 4℃. In addition, immobilization can improve the temperature and pH stability of cytochrome P450. Immobilized cytochrome P450 has the similar affinity Km values for herbicide chlorsulfuron and triasulfuron as the free cytochrome P450. In the case of chlorosulfuron, affinity Km value is 53μmol/L for free cytochrome P450,and 63μmol/L for immobilized cytochrome P450, respectively. In the case of triasulfuron affinity, Km value is 36μmol/L for free cytochrome P450, and 44μmol/L for immobilized cytochrome P450, respec-tivily. Immobilized cytochrome P450 will be convenient, rapid, stable and continuous for herbicide metabolism in micro-bioreactor in vitro.     

5-azaC处理对低温弱光胁迫下黄瓜幼苗抗氧化酶活性的影响

为了研究5-azaC处理与植物耐冷性机理之间的关系,本实验以黄瓜幼苗为试材,研究了不同浓度5-azaC处理对低温弱光(10℃/6℃,300(μmol/m~2)/s)胁迫下黄瓜幼苗抗氧化酶活性的影响。结果表明:与对照相比,喷施500~800μmol/L的5-azaC处理可以显著降低幼苗叶片内MDA含量(P0.05),在低温24 h时分别降低了19.45%、19.83%,低温48 h时分别降低了12.19%、16.20%;提高SOD、CAT、APX和GR抗氧化酶活性,有效降低了黄瓜幼苗在低温弱光胁迫下活性氧(H_2O_2和O_2~-)的产生和积累;但随着浓度的升高,1000~5000μmol/L的5-azaC处理导致黄瓜叶片膜脂过氧化产生,使抗氧化酶活性显著降低,导致植物产生氧化损伤。