GFAP单克隆抗体制备及ELISA检测方法研究

制备抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)单克隆抗体,并尝试建立双抗夹心ELISA检测方法,为出血性脑卒中早期诊断提供基础材料.用重组人GFAP作为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗GFAP单克隆抗体;用HRP标记单克隆抗体,ELISA和Western blot检测抗体的亚类、表位和特异性;采用ELISA技术制备GFAP检测试剂盒.获得了7株抗GFAP单克隆抗体,抗体亚类为Ig G2或Ig G1,抗体特异性好.抗体配对成功,ELISA检测重组人GFAP灵敏且稳定.     

抗人FXYD6单克隆抗体的制备及鉴定

制备了抗人FXYD6单克隆抗体,并进行初步鉴定.以FXYD6合成多肽作为免疫原,利用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株;腹水诱导法制备抗人FXYD6单克隆抗体;蛋白A亲合层析法纯化;ELISA测定FXYD6单克隆抗体的特异性和效价;以所得特异性抗体为一抗,利用免疫组化法检测胰腺癌组织中FXYD6的表达.结果成功获得1株稳定分泌特异性抗人FXYD6单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水诱导法生产抗人FXYD6单克隆抗体2.86 mg;FXYD6单克隆抗体可以与FXYD6合成多肽特异性结合,抗体效价1:5400;免疫组织化学显示胰腺癌组织中胞膜呈阳性染色.成功获得FXYD6单克隆抗体可以为进一步研究FXYD6的组织分布、生物学作用创造条件.     

抗Der p 2单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的:建立Der p 2(屋尘螨Ⅱ类变应原)杂交瘤细胞株,并对其分泌的Der p 2单克隆抗体进行鉴定.方法:用重组Der p 2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和3次克隆化,制备出单克隆抗体.采用间接ELISA法、Western blot法确定单克隆抗体的免疫球蛋白的类型和亚类、相对亲和力、特异性,对单克隆抗体进行鉴定.结果:获得3株能稳定分泌高效价Der p 2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,1B6为IgG1类,1G11、4B1为IgG2a类.间接ELISA法检测细胞上清效价为104~105,腹水效价为105~106.Westernblot试验证明3株单抗与Der p 2蛋白均有特异性反应.结论:成功制备了3株抗Der p 2的单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立Der p 2蛋白检测和纯化的方法奠定了基础.     

抗棉铃虫组织蛋白酶B单克隆抗体的制备及鉴定

分别以棉铃虫组织表达的组织蛋白酶B和基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B为抗原免疫BALB／c小鼠，选择血清抗体滴度高的免疫小鼠，取其脾细胞和Sp2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合．经ELISA法筛选阳性克隆和有限稀释法克隆细胞，共获得分泌抗组织蛋白酶B的单克隆抗体杂交瘤细胞3株，分别命名为9D5，100E2和100H6．以ELISA法和Western blotting法对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了特异性鉴定，其中9D5和100E2能够同时识别两种不同来源的组织蛋白酶B，而100H6只能识别基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B．     

小麦GLB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以小麦主要过敏原Glb-1蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。采用细胞融合和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水并用蛋白A亲和层析法纯化抗体后检测。采用间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的IgG亚型;通过间接ELISA鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。利用双单抗夹心ELISA法检测单抗的抗原表位特异性。结果表明:共获得4株可稳定分泌小鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白的单克隆抗体,分别命名为1C4、4H5、1A9、4F5,经检测其Ig亚型均为IgG1,且4株单抗效价均在10-9以上。ELISA结果分析表明该4株单抗均能特异性识别小麦主要过敏原Glb-1蛋白且和其他常见食物无交叉反应性。将4株单抗两两配对进行ELISA实验,结果发现1C4与4H5可能有不同的抗原表位,以此建立的双抗夹心ELISA系统可以检测小麦Glb1-G3蛋白。实验成功制备了鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白抗原的单克隆抗体,并且建立了双单抗夹心ELISA检测系统,为小麦主要过敏原蛋白的检测奠定了基础。     

脊髓灰质炎病毒I型单克隆抗体的制备

目的: 为建立脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体．方法:以Vero细胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度离心法纯化后,用病毒免疫SPF级Balb/c小鼠．取小鼠免疫脾淋巴细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接 ELISA 法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法克隆化．用细胞培养法制备脊灰病毒单抗,并以中和试验测定单抗效价．结果:获得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株I型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株G8G7能够稳定分泌抗体．间接ELISA 法测得单抗的效价为1∶8,中和试验测得中和抗体的效价为1∶58．结论:G8G7分泌的抗体为抗脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体.     

抗甲胎蛋白单克隆抗体的研制及其在免疫组化中的应用

以高纯AFP为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠SP2/0 Ag14骨髓瘤细胞融 合,经2次亚克隆,建立5株稳定分泌抗AFP特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。应用经纯化 的该单克隆抗体进行了原发性肝癌组织切片的免疫组织化学实验,结果显示全部5种抗AFP单 克隆抗体对肝癌亚细胞组分均呈现特异性结合。表明已筛选出适于制作甲胎蛋白临床诊断试 剂盒所需的特异性单克隆抗体。     

抗KDR-Fc杂交瘤细胞系的建立

用杂交瘤技术建立抗KDRFc的杂交瘤细胞系,以KDRFc抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法检测和有限稀释法克隆培养,再经稳定性检测、效价检测,筛选出分泌抗KDRFc单克隆抗体的杂交瘤细胞.得到了10株能持续分泌抗KDRFc的单克隆抗体的细胞株,其中3株分泌的单抗具有较高的生物活性、特异性和稳定性.     

恒河猴犬瘟热病毒基因疫苗单克隆抗体的制备

从感染犬瘟热病毒死亡的恒河猴肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增H全基因并克隆到真核表达质粒pVAX中,构建了基因疫苗pVAX-H.用制备的基因疫苗免疫BaLb/c小鼠,小鼠可以产生免疫应答,免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA法筛选,获得5株稳定分泌抗CDV H蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该5株单抗对应不同的病毒抗原表位,且均不与CPV和MV发生反应,McAb诱生的腹水可体外中和犬瘟热病毒,其中2株中和效价大于1∶256.结果表明,CDV H基因疫苗可制备具有一定中和效价的抗CDV的单克隆抗体.     

采用重组小鼠凝血因子Ⅸ制备单克隆抗体的研究

将小鼠凝血因子Ⅸ (mFⅨ )cDNA蛋白编码区序列克隆至原核表达载体 pQE30 ,在大肠杆菌M 15中获得高效表达 (约占细菌蛋白总量的 5 1 2 % ) ,并经过SDS PAGE纯化获得均一的重组mFⅨ蛋白 .以此蛋白为抗原 ,免疫Lou/MN系大鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (Sp 2 / 0 )融合后 ,经 3次克隆化选择获 2株杂交瘤细胞(H4B5和C2B10 ) .以 1× 10 6杂交瘤细胞注射免疫缺陷型裸鼠 ,10d后获得腹水 .对此单抗的功能和特异性初步研究表明 ,所制备的抗小鼠FⅨ单抗可用于Western免疫印迹等研究 .     

抗小鼠雄性特异性抗原（H—Y抗原）单克隆抗体的研究

将经Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄鼠脾细胞免疫的同系雌鼠脾细胞与Ｂａｌｂ／ｃ小鼠骨髓瘤ＳＰ２／０细胞进行融合,以雌、雄鼠脾细胞作细胞性ＥＬＩＳＡ、间接免疫荧光和精细胞间接免疫荧光技术进行筛选,共建立了５株稳定分泌抗Ｈ－Ｙ抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞可在Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ与Ｂａｌｂ／ｃ杂交子一代雌性小鼠腹腔生长并形成腹水性抗体。鉴定结果证明这些抗体具有较好的特异性。     

抗基因工程人rIFN-γ杂交瘤细胞株的建立

用杂交瘤技术将基因工程人γ－干扰素（ｒＩＦＮ－γ）免疫的Ｂ淋巴细胞与ｓｐ２／０鼠骨髓瘤细胞融合，建立了 ３株抗 ｒＩＦＮ－γ杂交瘤细胞株。这些细胞株经两年多的传代培养仍保持稳定分泌抗体的能力，并与ｒＩＦＮ－γ及新型γ－干扰素呈特异性反应，可用于亲和层析纯化γ－干扰素．     

An anti-idiotype vaccine against experimental schistosomiasis

Schistosomiasis is a parasitic infection of man which is widespread in tropical countries, and which so far has resisted attempts at control. We have been approaching the problem from an immunological angle. We have previously reported the production of a rat monoclonal IgG2a antibody against Schistosoma mansoni which exhibits marked cytoxicity for schistosomula in the presence of eosinophils and a high degree of protection by passive transfer in naive rats. This antibody, IPLSm1, was shown to bind specifically to a schistosomulum membrane target antigen defined as a glycoprotein of relative molecular mass 38,000 (38K), which is strongly immunogenic in schistosome infection of various animal species including man. Although theoretically the 38K protein represents an excellent candidate for a potential vaccine against schistosomiasis, the glycanic nature of the epitope recognized by IPLSm1 limits its production by DNA recombinant technology. It was, moreover, shown that, together with protective antibodies, the 38K molecule was able to induce the production of blocking IgG2c antibodies that inhibit the functional properties of IPLSm1 both in vitro and in vivo. Therefore, following Jerne's network theory, we considered an alternative approach, the possibility of immunization using anti-idiotype antibodies. In the present study, rat monoclonal anti-idiotype antibodies were produced against IPLSm1 (AB1). Anti-idiotype antibodies (AB2) were selected by their capacity to inhibit the binding of radioiodinated AB1 to its 38K target antigen. Sera from naive LOU rats immunized with a purified AB2 preparation contained specific anti-schistosome antibodies (AB3) which bound to 38K. AB3 antibodies were strongly cytotoxic for schistosomula in the presence of rat eosinophils and conferred highly significant protection by passive transfer. Most importantly, rats immunized with AB2 demonstrated marked protection (50-80%) to a challenge infection.     

抗人癌胚抗原单克隆抗体的研制及其在免疫组化中的应用

以高纯CEA为抗原,免疫BALB／c小鼠．取其脾细胞和小鼠SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞融合．经2次亚克隆。建立3株稳定分泌抗CEA特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。应用经纯化的该单克隆抗体进行了结肠癌组织切片的免疫组织化学实验．结果显示全部3种抗CEA单克隆抗体对结肠癌亚细胞组分均呈现特异性结合。表明已筛选出适于制作癌胚抗原临床诊断试剂盒所需的特异性单克隆抗体。     

汉滩病毒G1重组腺病毒的表达及其免疫学特性研究

将汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G1重组腺病毒(Adeno-G1)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物;并进一步将其免疫Balb/c小鼠。结果可检测到HTNV糖蛋白G1在VeroE6细胞中表达;用该重组腺病毒免疫小鼠,结果表明免疫小鼠体内可诱导产生抗汉滩病毒G1特异性抗体,同时微量细胞培养中和实验结果表明重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体,但淋巴细胞增殖反应不明显。说明Adeno-G1免疫小鼠后,主要刺激机体产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,但刺激机体产生特异性的细胞免疫应答不明显,为HTNV基因工程疫苗的研究提供了实验基础。     

心肌肌钙蛋白I-C复合物酶联免疫检测方法的建立

为了制备抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体、建立检测人cTnI链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用基因工程表达的人cTnI免疫雌性BALB/c小鼠,以杂交瘤技术制备得到三株特异性抗人cTnI的单克隆抗体记为6G3,6A6,3G9.三株杂交瘤细胞中6G3和6A6为IgG1,3G9为IgG2b,腹水效价分别为4×10-5,4×10-5和10-5.亲和常数为5.0×109,6.4×109和3.8×109mol-1.Westernblotting结果表明6G3和6A6能够识别cTnI-C复合物.把6G3抗体生物素化并制备抗cTnI、cTnC和cTnI-C的大鼠多克隆抗体.以多抗作为固相捕捉抗体,生物素化6G3抗体作为检测抗体,建立检测cTnI的双抗体夹心ELISA方法并初步应用于临床病人标本检测.以cTnI-C复合物多抗捕捉检测方法具有良好的灵敏度、特异性和准确性,灵敏度为0.9ng/mL,较包被其他抗体捕捉方法提高1~2倍.批内变异系数为5.03%,回收率为94.56%.测定17例AMI病人和18例血清样本临床诊断结果符合率为100%.     

Evidence for existence of a close association between CD14 and CXCR4 on monocytic cell line U937

The surface expression of HIV-1 coreceptors (CXCR4 and CCR5) on monocytes can be regulated by the ligand of CD14,and the susceptibility of the cells to HIV-1 is then changed.Our previous study found that monoclonal antibody against CD14 could dramatically inhibit CXCR4-mediated chemotaxis and cell-cell fusion.Based on these studies,we explored potential relationship between CD14 and CXCR4 on monocytic cell line U937.Flow cytometry analysis showed that anti-CXCR4 monoclonal antibody (mAb) 12G5 strongly inhibited binding of the FITC-conjugated anti-CD14 monoclonal antibodies (TUK4 and UCHM1) to U937,while another CX- CR4-specific mAb B-R24 did not show any effect on this binding.On the other hand,two anti-CD14 monoclonal antibodies (TUK4 and UCH-M1) obviously inhibited the binding of the PE-conjugated anti-CXCR4 mAb 12G5 to U937 but did not inhibit the binding of mAb 12G5 to CXCR4-transfected 3T3 cells (3T3.T4.CXCR4),which indicates that the blocking of mAb 12G5 binding to CXCR4 by CD14- specific mAbs is not involved in the possibility that CD14-specific mAbs directly bind to CXCR4.These results suggested existence of a close association between CD14 and CXCR4 on monocytic cell line U937.     

人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体的制备与鉴定

 为了获得抗人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体,以重组hLIF蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的小细胞融合、无限稀释法制备了10株杂交瘤的腹水hLIF抗体,并对腹水进行了纯化.腹水粗品抗体经rProteinA一步亲和层析法纯化和鉴定后,抗体分子量都符合抗体的特性,抗体的纯度都达到了96.6%以上,抗体亲和常数在1.89×10-9~1.51×10-12mol/L,其中1B8a、5C1b、5G4a细胞株制备的抗体属于高亲和力抗体,可以对其的应用进行进一步的研究和探讨.     

小鼠免疫脾细胞与SP2／0细胞融合的杂交瘤细胞的超微结构研究

对ＳＰ２／０骨髓瘤细胞、免疫脾细胞和由二者融合而分泌抗水貂肠炎病毒（ＭｉｎｋＥｎｔｅｒｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ，ＭＥＶ）单克隆抗体的杂交瘤细胞超微结构进行了研究．经ＭＥＶ免疫的动物的脾细胞糙面内质网发达，细胞质与细胞核的比例增大．贴壁生长的ＳＰ２／０细胞的表面中央为微绒毛集中区，其余部分则遍布皱褶，细胞质中内质网不发达．由ＳＰ２／０细胞和免疫牌细胞融合形成的杂交瘤细胞，表面均匀分布有皱褶，无微绒毛，细胞在贴壁基部周围伸出裙状伪足，扩大了贴壁面积，使细胞贴壁较牢固．本实验还对ＳＰ２／０细胞和杂交瘤细胞的染色体做了计数，二者的平均数分别为６７和９７，在传代培养中染色体有丢失现象．