一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法的建立及对Atsttrin-TNFR2相互作用的分析

创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法,用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象,分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-EYFP蛋白孵育后,经离心收集复合物,通过酶标仪检测其荧光值,从而分析Atsttrin和TNFR2间的相互作用.通过荧光值的检测成功分析了Atsttrin和TNFR2间的相互作用,荧光值的检测可代替传统方法中的Western blot分析,从而简化GST-pull down分析步骤、降低操作难度、并可对缺乏特异性抗体的靶蛋白进行有效地分析.     

绿色荧光蛋白标记S2P在集胞藻6803中的表达

为研究集胞藻6803中两个S2P同源蛋白酶Slr0643和Sll0862的功能,分别在两个蛋白酶的羧基端添加增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签,构建了两株转基因集胞藻psbA2::0643GFP-Cmr/△0643-Kmr和psbA2::0862GFP-Cmr/△0862-Kmr.通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测到egfp基因的转录表达,通过激光共聚焦显微镜检测到转基因集胞藻细胞发出的绿色荧光蛋白荧光,表明带EGFP标签的S2P融合蛋白在psbA2启动子调控下正确表达.     

LC-MS法测定拟南芥原生质体脱落酸的研究

利用高效液相色谱与质谱联用法(LC-MS法)对从土培拟南芥叶片和水培拟南芥根系中分离的原生质体进行脱落酸含量分析.结果表明,所测原生质体的脱落酸含量与原生质体数目之间具有较好的线性关系,相关系数分别为0.992 3和0.993 1.脱落酸含量的检测下限为1.07 ng/mL,土培拟南芥叶片和水培拟南芥根系原生质体检测下限分别为3万个和2万个.该研究以原生质体为材料,避免了细胞间隙中的复杂化学成干扰,提高了植物激素测定的灵敏度和精度,完善了经典的植物激素测定技术.     

绿色荧光蛋白α2b-干扰素融合蛋白的表达与活性研究

采用基因重组技术,构建原核表达质粒pET 32a( )/GFP-α2b-IFN,转化大肠杆菌BL 21,以IPTG诱导融合蛋白的表达并用镍金属螯合层析柱进行纯化.SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,46.0 kD的融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达,并具有α2b-IFN的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与W ISH细胞上的干扰素受体特异性结合,并在激发光下呈亮绿色荧光.采用细胞病变法测定分离纯化的融合蛋白的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/m g.表达的GFP-α2b-IFN融合蛋白具有α2b-IFN的特性与荧光活性,为研究α2b-IFN受体功能以及IFN与细胞相互作用的机理奠定了基础.     

一个与ABA信号通路相关未知基因AB的亚细胞定位研究

本研究通过构建一个与脱落酸（ABA）信号传导途径相关的未知基因AB和绿色荧光蛋白（GFP）编码基因的重组质粒,利用基因枪技术将该重组质粒成功转入洋葱表皮细胞,观察并确定了该基因编码蛋白细胞核和细胞质的亚细胞定位,为进一步研究该未知基因的生物学功能及其分子机制提供了思路.     

脱落酸信号调控植物干旱胁迫响应的研究进展

对脱落酸代谢途径和信号途径在干旱胁迫响应中的调控作用进行了综述，揭示脱落酸介导的信号网络调控植物应答干旱的分子机制，同时对异三聚体G蛋白参与脱落酸信号调控干旱胁迫响应的最新研究进行介绍，最后对未来脱落酸调控干旱胁迫响应的研究方向提出了展望，以期为今后深入研究脱落酸信号调控干旱胁迫响应及培育抗旱能力强的植物提供理论参考.     

维隆气单胞菌外膜蛋白AII的植物瞬时表达系统的构建

以维隆气单胞菌HBJY01为模板通过PCR技术扩增其外膜蛋白AII(AvompAII)基因片段,将序列正确的AvompAII基因片段与含有黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,yfp)基因的表达载体pCAMBIA1300重组,将该重组表达载体转化到农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101中用于转染烟草叶片细胞.通过激光扫描共聚焦成像系统检测方法和RT-PCR的方法来检测融合表达AvompAII基因的黄色荧光蛋白的表达与AvompAII基因在烟草叶片中的转录情况.从维隆气单胞菌HBJY01中克隆出大小为996bp的AvompAII基因序列,并成功构建了AvompAII蛋白的植物瞬时表达系统.通过该方法能方便可靠地构建植物瞬时表达系统,并进一步对维隆气单胞菌所引起的水产疾病的发现和实际生产应用提供了实验基础.     

荧光定量检测细胞绿色荧光蛋白技术的建立与应用

绿色荧光蛋白是在生化与分子生物学研究领域中普遍使用的一种基因表达报告系统显色物.对于细胞内绿色荧光蛋白表达水平的定量检测,目前尚缺乏一套准确﹑简便﹑易行的技术.本文以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,用分子量为25 ku的线性聚乙烯亚胺介导进入HeLa细胞并表达.利用多功能酶标仪测定细胞裂解液的荧光强度,结果显示:这种新方法测定的荧光强度能很好反映细胞中EGFP的蛋白表达水平,并在短时间内完成对EGFP表达水平的定量检测.该方法简单有效,且不依赖于大型仪器设备,具有较高的准确性与灵敏度,在实际应用中简便可靠,具有推广应用的意义.     

Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP慢病毒载体的构建与鉴定

构建含有myc-KyoT2融合基因片段的病毒载体,并在真核细胞中表达鉴定.方法:由科室保存质粒分别酶切得到Plenti/V5、IRES2-EGFP和myc-KyoT2基因片段,分别将myc-KyoT2基因片段插入质粒pIRES2-EGFP得到myc-KyoT2-IRES2-EGFP,然后将myc-KyoT2-IRES2-EGFP基因片段插入质粒Plenti/V5-GFP,构建病毒载体Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,应用免疫印记和荧光显微镜检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达.获得了质粒myc-KyoT2-IRES2-EGFP和Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,myc-KyoT2融合蛋白和绿色荧光蛋白均正确表达.说明成功构建了含有myc-KyoT2-IRES2-EGFP融合基因的病毒载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础.     

ABA受体RCAR1/PYL9相互作用蛋白质的筛选及初步研究

使用拟南芥作为模型,采用酵母双杂交系统筛选出和ABA受体RCAR1/PYL9有相互作用的蛋白质,以更深入的研究RCAR1/PYL9的功能.首先利用反转录PCR方法获得拟南芥的cDNA,然后通过酵母双杂交系统,用拟南芥RCAR1/PYL9作为诱饵蛋白对拟南芥cDNA文库进行筛选,并获得多个阳性克隆.对该菌落进行进一步的鉴定得到与RCAR1/PYL9具有相互作用的蛋白质,这对进一步研究RCAR1/PYL9及其相互作用蛋白质在ABA信号转导途径中的作用及地位奠定了基础.