AtMYB44与ABI1竞争性结合ABA受体RCAR1的研究

为了进一步确定AtMYB44、ABI1、RCAR1三者之间的关系,本文进行了竞争性pull down和ABI1磷酸酶活性的测定实验,结果表明AtMYB44与ABI1能够竞争性结合RCAR1,并且这种竞争性结合依赖于ABA,AtMYB44能够降低RCAR1对ABI1活性的抑制,这为深入研究ABA信号转导途径奠定了基础.     

拟南芥AtDWD与RCAR1相互作用的初步研究

采用pull down和酵母共转化的方法研究了AtDWD与RCAR1之间的相互作用.体外pull down试验得出AtDWD与RCAR1之间存在明显的相互作用;酵母共转化试验显示AtDWD的截断区域中只有WD45和WD345转化子可以在SD四缺培养基平板上长出正常的酵母菌落.实验结果表明,AtDWD C端的145~350位氨基酸序列中含有与RCAR1相互作用的功能域.     

酵母双杂交筛选与脱落酸受体相互作用的蛋白质及其重转酵母的验证

脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,它能使植物适应逆境胁迫,从而调节植物的生长发育状况.现今ABA受体已被公认为RCARs/PYR/PYLs家族蛋白.本实验通过拟南芥为模式植物,利用酵母双杂交系统共转化方法从拟南芥cDNA文库中筛选与RCAR3相互作用的蛋白质,获得多个阳性克隆,从中选取一个与生长素调节相关的基因NIT1的全长cDNA重新转化酵母验证,发现与RCAR3仍然有相互作用,排除了假阳性的可能.从而为下一步研究该基因与RCAR3的相互关系做好了准备.     

拟南芥AtMYB44与RCAR1相互作用的研究

以拟南芥脱落酸(ABA)受体RCAR1和以文为诱饵蛋白质,利用酵母双杂交(Y2H)技术筛选出转录因子AtMYB44,本文进行了pull down及重转酵母验证,确定它们之间的关系,实验结果显示RCAR1与AtMYB44之间确实存在相互作用.此外,为了确定RCAR1在AtMYB44上的作用区域,构建了不同长度的AtMYB44cDNA序列的PGADT7载体,利用酵母双杂交实验分析,表明只有AtMYB44的N端54~105氨基酸序列与RCAR1存在相互作用.     

拟南芥AtDWD与ABI2相互作用的初步研究

本文以RCAR1为诱饵蛋白通过酵母双杂交（Y2H）技术筛选出了DWD基因编码的蛋白,同时在用ABI2参与筛选的过程中,同样得到了DWD这个基因. 进行了pull down 实验验证它们之间的相互作用,实验结果显示：在体外,RCAR1、RCAR3与DWD之间确实存在相互作用,同时ABI2与DWD也存在相互作用. 其后对DWD结构的进行分析和实验,发现ABI2和DWD的相互作用区域集中在AtDWDC端,大概是145~350位氨基酸之间的WD40结构域里.     

ABA受体RCAR1/PYL9相互作用蛋白质的筛选及初步研究

使用拟南芥作为模型,采用酵母双杂交系统筛选出和ABA受体RCAR1/PYL9有相互作用的蛋白质,以更深入的研究RCAR1/PYL9的功能.首先利用反转录PCR方法获得拟南芥的cDNA,然后通过酵母双杂交系统,用拟南芥RCAR1/PYL9作为诱饵蛋白对拟南芥cDNA文库进行筛选,并获得多个阳性克隆.对该菌落进行进一步的鉴定得到与RCAR1/PYL9具有相互作用的蛋白质,这对进一步研究RCAR1/PYL9及其相互作用蛋白质在ABA信号转导途径中的作用及地位奠定了基础.     

拟南芥AtDWD与DDB1相互作用研究

本文通过酵母双杂交实验(Y2H)和双荧光互补实验(BIFC)分别从体外和体内条件下检测了AtDWD与CUL4型E3连接酶的底物识别蛋白结合蛋白DDB1a和DDB1b的相互作用,发现AtDWD与DDB1b有较强的相互作用,而与DDB1a的相互作用较弱,相互作用区域位于AtDWD的C末端部位.说明了AtDWD是潜在的CUL4型E3连接酶的底物识别亚基.此外,本文中还发现AtDWD过表达植株对冷冻胁迫更加敏感.AtDWD可能参与冷胁迫信号通路.     

VDAC3与ABA受体蛋白相互作用的验证以及初步研究

酵母双杂交技术在拟南芥cDNA文库中筛选得到了与ABA受体蛋白RCAR1,RCAR3均有相互作用的蛋白质VDAC3,并已获得VDAC3基因的全长.VDAC3蛋白包含有3个结构域,分别为Porin3结构域,DUF3442结构域和SEG片段,现根据结构域分布,将VDAC3截短为包含DUF3442的VDAC3N以及包含SEG的VDAC3C两段.将VDAC3全长以及分别截短的169个氨基酸(VDAC3N)及105个氨基酸(VDAC3C)的片段进行酵母转化实验,与RCAR1或RCAR3共同转化后,VDAC3,VDAC3N的共转酵母能够在缺陷型培养基上生长,并且使X-Gal显色为蓝色,而VDAC3C则不能.这验证了全长的VDAC3与RCAR1,RCAR3的存在相互作用,并发现决定VDAC3蛋白与RCAR1,RCAR3是相互作用的结构域位于N端的DUF3442结构域.