Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP慢病毒载体的构建与鉴定

构建含有myc-KyoT2融合基因片段的病毒载体,并在真核细胞中表达鉴定.方法:由科室保存质粒分别酶切得到Plenti/V5、IRES2-EGFP和myc-KyoT2基因片段,分别将myc-KyoT2基因片段插入质粒pIRES2-EGFP得到myc-KyoT2-IRES2-EGFP,然后将myc-KyoT2-IRES2-EGFP基因片段插入质粒Plenti/V5-GFP,构建病毒载体Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,应用免疫印记和荧光显微镜检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达.获得了质粒myc-KyoT2-IRES2-EGFP和Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,myc-KyoT2融合蛋白和绿色荧光蛋白均正确表达.说明成功构建了含有myc-KyoT2-IRES2-EGFP融合基因的病毒载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础.     

Abd-Bcr/Abl原核表达载体的构建和表达

构建Bcr/Abl-Abd原核表达载体,并表达、观察对白血病细胞K562的影响.以慢性白血病PGD210质粒为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增出Abd编码区序列,克隆入pMD18t载体,经酶切测序鉴定正确.再通过酶切重组克隆入原核表达载体pET32a,构建pET32a-Abd重组表达质粒,经酶切、测序鉴定,序列、读码框均正确.通过转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,纯化.结果PCR扩增出特异性的501bp的目的片断,以此构建的重组质粒pET32a-Abd能够在上清中表达约36.6 kd的目的蛋白,Westem blot鉴定为特异表达.证明成功构建了原核表达载体pE732a-Abd,并表达在上清中,表达蛋白约占菌体总蛋白的6%,纯化后达到74.3%,Westem blot检测为特异性表达,为进一步研究该蛋白对慢性白血病细胞的作用奠定了分子基础.     

人IFN-γ在大肠杆菌中高效表达和色谱复性研究

从健康人外周血分离单核细胞，经LPS刺激后提取总RNA，用RT—PCR扩增hIFN-γ的cD—NA。将扩增产物克隆后进行序列分析证明，克隆的hIFN-γcDNA除存在2个序列多态性位点外，与天然的干扰素氨基酸序列完全一致。利用温控表达系统在大肠杆菌中实现了hIFN-γ的高效表达，表达的目的蛋白可占茵体总蛋白的55％。用5L和50L发酵罐放量生产的产物，经高效疏水色谱HPHIC直接复性和纯化得到了重组hIFN-γ纯品，其比活性与天然蛋白相近．     

LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析

KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.