甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri fad2基因片段克隆及hpRNA植物表达载体的构建

首先利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和Lesquerella fendleri基因组DNA中分别扩增出Δ12-脂肪酸去饱和酶fad2基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出相应的小片段,然后将同一基因的大小片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的napin启动子和nos终止子之间,构建成可以在种子中转录表达发夹RNA(Hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体.     

甘蓝型油菜S-GT基因克隆、hpRNAi载体构建及遗传转化

根据发表的甘蓝型油菜S-GT基因cDNA序列设计引物,以甘蓝型油菜总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长.根据获得的基因序列设计引物扩增出S-GT基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到带有本实验所构建的种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了油菜S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体.通过根瘤农杆菌EHA105介导,转化甘蓝型油菜‘hubu 11'的子叶柄,诱导愈伤组织分化出绿芽,进而再生出完整的植株.通过PCR初步鉴定获得了58株转基因阳性植株.     

甘蓝型油菜植物防御素基因的克隆与原核表达

根据Genbank上已知的植物防御素基因设计引物，以甘蓝型油菜中的品种”蜀杂九号”种子总RNA反转录成的eDNA为模板，进行PCR扩增，获得了243bp的片段．将该片段回收。连接到pMD18-T载体测序，将测序片段经酶切回收后克隆到GTK表达载体中，在0．1mmol IPTG诱导下表达出与理论值相符的34kD的融合蛋白条带，用GST单克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测，获得阳性结果，这为甘蓝型油菜植物防御素基因功能的进一步研究提供了基础．     

甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体pFGC5941-BnBRI1和RNA干扰载体pFGC5941-BnBRI1-Ri,以根癌农杆菌介导的方法转化甘蓝型油菜"W679"下胚轴外植体,经PCR鉴定,获得18株转基因阳性植株,其中1株为BnBRI1基因过量表达转基因植株,17株为BnBRI1基因RNA干扰转基因植株.经RT-PCR鉴定显示,在过表达转基因植株中BnBRI1基因表达量比野生型甘蓝型油菜高,而在RNA干扰转基因植株中表达量比野生型低,RNA干扰BnBRI1基因的表达导致了植株的矮化,矮化植株将可用于油菜株型的遗传改良,以培育适于机械化生产的中矮秆油菜新品种.     

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

半胱氨酸蛋白酶基因RNA干扰表达载体的构建及油菜的遗传转化

将半胱氨酸蛋白酶基因(Bncp5)cDNA序列片段正反向插入表达载体pFGC5941中,构建了RNA干扰表达载体pFGC-Bncp5-RNAi.采用根癌农杆菌介导法,转化甘蓝型油菜下胚轴.在5mg/L BastaMS培养基中筛选,PCR鉴定结果显示,获得Bncp5转基因植株28株.半定量PCR分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因在转基因油菜中表达受到一定程度的抑制,表明Bncp5的干扰载体在油菜中得到表达.     

拟南芥抗旱相关基因的表达载体构建及转基因植株鉴定

文章以拟南芥Col-0植株的基因组DNA和cDNA为模板扩增出LWT2基因全长和CDS片段,用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit试剂盒连接至中间载体,转化到Trans1-T1感受态细胞内,通过单克隆挑选、菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定及质粒测序验证获得DNA阳性克隆。利用限制性内切酶双酶切获得含有黏性末端的目的片段和载体片段,进行DNA连接反应可得最终的互补和过表达构建。提取质粒DNA测序确认后将2个构建分别转化至农杆菌菌株GV3101,菌落PCR鉴定后通过浸花转化法转化拟南芥lwt2-1突变体植株,最后通过转基因筛选与遗传鉴定获得相应构建的转基因阳性植株。     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

甘蓝型油菜BnD11基因过量表达载体的构建及遗传转化

构建了BnD11过量表达载体pFGC5941-BnD11,转化甘蓝型油菜“1821”品系获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示转基因植株中BnD11基因的表达量有显著提高,盐胁迫实验结果初步显示,转基因油菜抗性得到提高.     

甘蓝型油菜FAE1基因启动子的克隆和瞬时表达载体的构建及功能分析

油菜脂肪酸延长酶基因FAE1是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,根据GenBank上已知的植物FAE1基因启动子序列设计引物,以从甘蓝型油菜(Braccica napus.L)叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1 328 bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列在NCBI进行blast比对,同源性为99.78%,说明该片段与植物中已知的FAE1基因的启动子序列有极高的相似性.将该片段替换掉改造后的pBI221上面的35S启动子从而构建了原生质体瞬时表达载体.然后通过PEG介导的方式将含有FAE1启动子驱动的荧光素酶报告基因(LUC)表达载体导入油菜原生质体中,研究报告基因表达量,证明出脱落酸(ABA)影响了报告基因的表达,随着ABA浓度的不断增加,LUC的表达量呈现逐步下降的趋势.     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5''端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物，以绵羊基因组DNA为模板，PCR扩增出1042bp的特异性片段，连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物，在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

海甘蓝硫甙合成关键酶S-GT基因克隆及种子特异性hpRNAi载体构建

根据甘蓝型油菜S-GT(thiohydroximate S-glucosyltransferase)基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增.获得S-GT基因全长.克隆的海甘蓝S-GT序列与甘蓝型油菜序列相比,除74 bp的内含子部分外有92个碱基的差别,相似性高达93.4%.分析显示该序列均有完整的开放阅读框,并表明所克隆的海甘蓝S-GT序列编码465个氨基酸,在第10个位点上比甘蓝型油菜序列少一个丙氨酸(A),总共有23个氨基酸不同,相似性为95.06%.根据获得的基因序列设计引物扩增出同一基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到已构建的带有种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了海甘蓝S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体,为特异性降低海甘蓝的种子硫甙奠定了基础.     

Plcd1转基因小鼠的制备

通过制备Plcd1转基因小鼠研究Plcd1基因功能.首先逆转录PCR获得约2.2kb的Plcd1基因全长,T载体克隆后测序验证;以pMD19-T-Plcd1为模板,通过设计引物及PCR扩增引入酶切位点,与pEF6/V5-His同时进行酶切、连接,构建pEF6/V5-His-Plcd1表达载体;经真核表达验证后,酶切获得目标片段,显微注射681枚受精卵,在82只仔鼠中获得转基因阳性首建鼠15只,其中13只稳定遗传并建系.PLCD1-HIS融合蛋白在睾丸组织中表达,在皮肤组织中无表达.Plcd1转基因小鼠为Plcd1功能研究奠定了基础.     

甘蓝型油菜BnFAD8基因编码序列的克隆和表达谱分析

通过比对拟南芥等同源基因,克隆了甘蓝型油菜FAD8基因中的保守序列.以得到的FAD8（Fatty Acid Desaturase 8）保守序列片段为信息探针,在GenBank的EST数据库中检索高度同源的EST,并通过人工拼接及RTPCR得到油菜该基因的全长为1299 bp的cDNA序列,命名为BnFAD8.序列分析结果中发现该基因符合质体定位的ω3脂肪酸脱饱和酶序列特征.通过比较22 ℃和8 ℃处理的甘蓝型油菜的BnFAD8基因表达谱,发现该基因在常温下仅存在痕量表达;而在低温条件下在叶中表达出现     

BnGID1基因干扰载体的构建和对甘蓝型油菜的转化

BnGID1基因是本实验室克隆到的AtGID1基因在甘蓝型油菜(Brassica nupus L.)中的同源基因.为了验证该基因在甘蓝型油菜中的功能,我们利用pFGC5941双元载体构建了BnGID1基因的干扰载体并将其转化入甘蓝型油菜野生型“3529”中,得到了BnGID1基因表达被部分抑制的转基因植株.性状观察证明,在BnGID1基因表达被部分抑制后,植株表现出明显的矮化特征,高度显著降低,叶片产生皱缩.与水稻,拟南芥中的GID1基因缺失突变体的性状比较证明BnGID1基因具有与OsGID1,AtG     

甘蓝型油菜3个AP3重复基因植物反义表达载体的构建及遗传转化

利用pFGC5941构建了甘蓝型油菜3个AP3重复基因的植物反义表达载体pFGC5941-BnAP3-2、pFGC5941-BnAP3-3和 pFGC5941-BnAP3-4.采用快速冻融法,将载体导入农杆菌EHA105,转化甘蓝型油菜下胚轴.在5mg/L PPT的MS培养基中筛选,获得反义BnAP3-2基因的抗性再生植株31株,反义BnAP3-3基因的抗性再生植株20株,反义BnAP3-4基因的抗性再生植株42株.PCR鉴定结果显示,获得BnAP3-2反义的基因植株12株,BnAP3-3反义的转基因植     

FAE1启动子的克隆和转γ-TMT基因大豆的获得

脂肪酸链延长酶组分1(FAE1)是广泛存在于植物中催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,该反应是脂肪酸碳链延长的限速步骤,在油料种子胚中特异性表达.以拟南芥基因组DNA为模板,设计引物,扩增到该基因的启动子片段.序列分析表明,该片段长度为943 bp,与GenBank注册序列AF355982达99.5%同源,并含有与之完全相同的种子特异性表达元件,据此认定它具有种子特异性启动活性.将其与甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因连接,构建成表达载体pFAE1-TMT,通过农杆菌介导的方法转化大豆胚尖,获得28株卡那霉素抗性筛选植株,进一步PCR检测获得2株转γ-TMT基因植株.     

蓝型油菜BnD11基因过量表达载体的构建及遗传转化

构建了BnD11过量表达裁体pFGC5941-BnD11,转化甘蓝型油菜“1821”品系获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示转基因植株中BnD11基因的表达量有显著提高,盐胁迫实验结果初步显示,转基因油菜抗性得到提高.