小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.     

AKT通过调控FASN的脂质代谢促进小鼠肝脏肿瘤的形成

使用尾静脉高压注射基因转染技术将不同质量AKT基因转染至FVB/N小鼠肝脏,探讨不同AKT表达量对AKT/Ras介导的小鼠肝癌发生发展的影响.随机将6周龄雌性FVB/N小鼠分为3组,对照组尾静脉高压注射空载体质粒,模型组A尾静脉高压注射75μg AKT、75μg Ras质粒,模型组B尾静脉高压注射150μg AKT质粒、75μg Ras质粒.并在小鼠造模后第2、4、6周处死小鼠,记录体质量并取肝脏组织称肝质量,检测血清ALT、AST水平,观察并记录肝癌生长情况.最后检测小鼠肝脏AKT、p-AKT、FASN和Ras的表达情况,并检测3组小鼠肝脏脂肪累积变化情况.结果显示,在2周时模型组A与模型组B小鼠血清中ALT和AST水平均呈不同程度的升高,提示有肝功能损伤,但两组间无显著差异.两模型组小鼠肝脏均形成肿瘤,但模型组A小鼠体质量、肝脏质量、肿瘤结节数量和大小明显低于模型组B小鼠.AKT基因可明显增加小鼠肝脏组织FASN的表达,并提高小鼠肝脏组织脂质累积量,促进小鼠肝癌的发生和发展.     

电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究

以小鼠MAR（matrixattachmentregion）元件,牛β－酪蛋白（β－casein）基因5＇端2．0kb调控顺序,人凝血Ⅸ因子小基因（hFIXminigene）构建乳腺组织特异性表达载体,表达载体和质粒pSV－neo共转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,兔皮肤纤维细胞（RSF）和人胚肾上皮细胞（293细胞）．发现hFIX基因在CHO细胞中获得低水平表达,最高表达量为7．2ng／ml．在皮肤成纤维细胞中的表达量低于2ng／ml．在293细胞中没有表达．表达载体用stearylamine（SA）脂质体包埋后尾静脉注射哺乳期小鼠,hFIX蛋白在小鼠乳汁中表达水平高达87．34ng／ml．     

三七总皂苷对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及机制研究

目的 探讨三七总皂苷(PNS)对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及作用机制。方法 75只C57BL/6雄性小鼠，分为正常组、模型组和PNS低(50 mg·kg^-1)、中(100 mg·kg^-1)、高剂量(200 mg·kg^-1)组，每组15只。PNS治疗组小鼠按相应的剂量预保护7 d后，模型组和PNS治疗组小鼠以25 mg·kg^-1剂量尾静脉注射碘酸钠溶液，建立小鼠视网膜损伤模型。PNS治疗组继续灌胃给药28 d。采用眼底照相及OCT检测小鼠视网膜损伤情况；FFA法观察视网膜血管渗漏情况；HE染色观察小鼠视网膜组织形态变化；试剂盒检测血清中抗氧化指标水平，ELISA法检测小鼠血清中炎性细胞因子的表达水平；Western blot法检测各组小鼠视网膜组织细胞核内Nrf2、核内NF-κB p65、HO-1与NQO1蛋白的表达情况。结果 与正常组比较，模型组小鼠视网膜出现大量的黄白色类似玻璃膜疣状沉积，视网膜相对厚度下降(P<0.01),视网膜血管出现大面积的渗漏；血清中SOD活力与GSH含量下降(P...     

抗棉铃虫组织蛋白酶B单克隆抗体的制备及鉴定

分别以棉铃虫组织表达的组织蛋白酶B和基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B为抗原免疫BALB／c小鼠，选择血清抗体滴度高的免疫小鼠，取其脾细胞和Sp2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合．经ELISA法筛选阳性克隆和有限稀释法克隆细胞，共获得分泌抗组织蛋白酶B的单克隆抗体杂交瘤细胞3株，分别命名为9D5，100E2和100H6．以ELISA法和Western blotting法对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了特异性鉴定，其中9D5和100E2能够同时识别两种不同来源的组织蛋白酶B，而100H6只能识别基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B．     

血友病B基因治疗研究

血友病Ｂ是一种由于人凝血因子Ⅸ (ｈＦＩＸ)缺陷导致的严重出血性遗传疾病 ,临床治疗主要依靠输血或凝血酶原复合物 ,但这些常规的替代治疗不仅费用昂贵 ,易引起输血反应 ,更可能感染肝炎病毒或爱滋病病毒 .理论上 ,只有基因治疗可望从根本上治疗血友病Ｂ .本研究先后建立反转录病毒基因转移系统 ,高效转染小鼠、大鼠、兔和血友病Ｂ患者皮肤成纤维细胞等不同细胞 ,尤其是人ＦＩＸ在骨髓基质细胞的表达在国际同类研究中是首次报道 .人ＦＩＸ在兔体内表达水平和持续时间在同类研究中居世界领先水平 ;在国内首先建立了有关基因治疗的安全性检…     

转基因动物乳腺生物反应器研究

以转基因动物的乳腺组织即乳腺生物反应器生产药用蛋白 ,是近年来生物技术领域发展的重要方向 .利用转基因动物的乳腺组织能够生产出具有完全生物活性的药用蛋白 ,纯化简单 ,投资少 ,成本低 ,对环境没有任何污染 ,可以获得巨额经济效益 .人凝血因子Ⅸ是治疗血友病Ｂ的特异药用蛋白 ,我们和上海市医学遗传学研究所合作 ,在上海市科委资助下 ,开展了ｈＦＩＸ在转基因动物乳腺中特异表达研究 ,构建乳腺特异表达的ｈＦＩＸ载体和表达系统 ,通过显微注射制备乳腺特异表达ＦＩＸ的转基因小鼠和羊 ,在转基因奶山羊中检测到人凝血因子Ⅸ的表达 ;促血…     

mper核酶基因表达载体的构建及动物模型检测

目的　探讨 per基因直接参与阿片类精神依赖性药物的心理和生理成瘾作用机制和寻找一种治疗心理和生理成瘾的基因戒毒新方法 .方法　针对小鼠mper设计锤头状核酶基因序列 ,利用基因重组技术构建mperribozyme的表达载体 ,并直接导入小鼠脑内 .以剂量递增法形成吗啡依赖模型 ,用纳洛酮催促戒断 .结果　重组质粒组小鼠的刻板跳跃 ,湿狗样抖动和打洞次数与空质粒组 ,生理盐水组相比明显减少 ,但并不抑制小鼠的体重下降 .结论　mperribozyme的表达载体能在小鼠脑内产生mperribozyme ,并发挥酶切作用 ,切割mper ,抑制大部分吗啡戒断症状 .意义　导入重组有mperribozymeDNA的质粒于体内阻断mper表达 ,从而达到治疗药物成瘾的方法是一种具有良好应用前景 ,并值得深入研究的戒毒疗法 .     

乙型肝炎表面抗原基因DNA介导的体液免疫初步研究

用ＣＰＲ技术从纯化的乙型肝炎病毒核酸中扩增出ｐｅｒＳ２－Ｓ基因,并将其定向克隆于真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中,构建成带有完整的乙肝表面前Ｓ２抗原基因和Ｓ基因的重组质粒。重组质粒经酶切及部分序列分析鉴定后,瞬时转梁小鼠Ｌ细胞,ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清液有ＨＢｓＡｇ表达。用纯化的重组质粒静脉、肌肉和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,首次接种质粒ＤＮＡ３周后,血清抗体开始出现,再次加强２周后,阳性     

人B淋巴细胞刺激因子的真核表达以及表达条件的筛选

采用基因克隆、重组等方法，将人B淋巴细胞刺激因子（hsBLyS）基因从人胎盘cDNA文库中克隆出来，测序鉴定后得组构建成真核表达载体pcDNA3．1( )hsBLyS，然后用磷酸钙法和脂质体法分别转染真核宿主细胞COS－7，并在其中表达48h、36h、72h、96h；表达细胞经超声处理后离心，上清进行SDS－PAGE鉴定，结果表明：对于hsBLyS来说，磷酸钙法比脂质体法转染效果好，而且对于磷酸钙法，表达量是72h达到最高。     

当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-κB、TNF-α表达的影响

探讨当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和核转录因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响及其可能作用机制.小鼠连续腹腔注射4.0g·L-1麻黄素溶液,同时用当归多糖溶液(12.5,25.0g·L-1)进行灌胃,分别在5,10,15d时用分光光度法检测各组小鼠肝组织T-AOC、GSH-PX活性的变化,免疫组化法检测小鼠肝组织中NF-κB和TNF-α表达的变化.结果显示实验对照组小鼠肝组织T-AOC、GSH-PX活性明显降低(P0.01),肝组织NF-κB和TNF-α表达量显著增强(P0.05或P0.01),而当归多糖组T-AOC、GSH-PX活性与实验对照组相比显著升高,NF-κB和TNF-α表达量明显降低(P0.05或P0.01).结果表明,麻黄素影响小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-κB、TNF-α的表达,当归多糖能够提高小鼠肝组织抗氧化酶活性,抑制NF-κB和TNF-α的表达,对麻黄素致小鼠肝损伤有一定的保护作用.     

肿瘤基因治疗的临床应用

基因治疗方法是通过基因转导技术赋于靶细胞一种新的功能或改变靶细胞某些基因的表达状况。目前基因治疗的疾病主要包括遗传性疾病、免疫缺陷病、肿瘤等。1991年12月在复旦大学遗传学研究所进行了国际上首例血友病的基因治疗。两位由于凝血因子Ⅸ缺乏而患有血友病B的患者被重新植入了大量转移有正常Ⅸ因子基因的自身皮肤成纤维细胞,结果病人体内Ⅸ因子含量都成倍上升,取得较好疗效。1990年9月,美国国立卫生研究院(NIH)用基因疗法治疗了一位由于体内腺苷脱氨酶(ADA)缺乏而患者严重联合性免疫缺陷的病人,他们将转移有正常ADA基因的患者自身淋巴细胞体外培养后重新大量输回病人体内,实验结果令人鼓舞。目前基因治疗已应用于很多种疾病。 肿瘤的基因治疗始于九十年代。1990年美国NIH首次对一位晚期恶性黑色素瘤病人进行了基因转导的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)     

慢病毒载体感染小鼠曲细精管的研究

目的探讨基于慢病毒载体曲细精管注射方法建立转基因动物的可行性。方法将8只4w～5w龄的雄性昆明小鼠分为高剂量(2只)、低剂量(6只)2个实验组,曲细精管注射滴度分别为1×109、2×107TU/mL的绿色荧光蛋白慢病毒载体(LV-GFP),注射量均为20μL/testis。注射后第4w、8w分别处死高剂量组小鼠各1只,于第5w、13w、17w各处死2只低剂量组小鼠,取睾丸,通过PCR、荧光显微镜和免疫组化等方法检测睾丸组织中GFP基因及表达。结果3只低剂量和2只高剂量小鼠睾丸组织中均可检测到GFP基因;但GFP表达仅见于高剂量组小鼠睾丸,其分布范围主要集中于曲细精管基膜及管间隙。结论慢病毒载体可通过曲细精管注射感染小鼠睾丸组织,但其感染效率与病毒滴度有关。     

红芪多糖对db/db小鼠糖尿病心肌病心肌NF-κB p65与MMP-9表达的影响

目的:观察红芪多糖(HPS)对db/db小鼠心肌组织核转录因子(NF-κB p65)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白与mRNA表达的影响,探讨其防治心肌间质纤维化可能的作用机制.方法 :将60只雄性db/db小鼠随机分为5组:HPS高、中、低剂量组,罗格列酮组与模型组;12只雄性db/m小鼠为正常组.干预组小鼠连续灌胃8周,于干预前后每2周测空腹血糖、体质量各1次.第8周末心脏取血后,取心脏左室心肌组织,分别用于Masson染色、电镜观察心脏超微结构以及Western blotting、逆转录-免疫酶联反应(RT-PCR)法检测其NF-κB p65、MMP-9的蛋白与mRNA表达情况.结果:HPS干预8周后,与模型组比较:HPS高、中剂量组与罗格列酮组小鼠血糖下降明显(P0.05),干预组小鼠体质量变化无明显差异(P0.05);Masson染色可见亮绿色胶原纤维在心肌细胞间及血管周围明显增多且呈堆积状分布;电镜观察可见HPS高剂量组与罗格列酮组小鼠心肌组织内线粒体数量与破坏程度、糖原颗粒及脂滴沉积现象均有明显改善;Western blotting、RT-PCR检测结果显示,HPS高剂量组、罗格列酮组小鼠心肌组织中NF-κB p65、MMP-9的蛋白与mRNA表达量均明显降低(P0.05).结论:HPS可降低db/db小鼠心肌组织中NF-κB p65、MMP-9蛋白与mRNA的表达水平,减轻其炎症反应状态,对心肌的间质纤维化病变具有一定的防治作用.     

注液肿胀止血法在头部取皮术中的应用

目的：探讨注液肿胀止血法对减少头皮取皮过程中出血量的作用。方法：应用肾上腺素生理盐水溶液注入头皮下层，使头皮肿胀， 同注液量对取皮过程中出血的影响。结果：Ａ组和Ｂ组的出血量均明显低于Ｃ组（不注肿胀液）（P＜0．05），而A组又明显低于B组（P＜0．05）。结论：注液肿胀法通过肿胀液压迫血管管和肾上腺素收缩血管的共同作用。可明显减少以取皮过程中的出血。     

H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫/杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。     

靶向基因疫苗pcDNA3/MDC-VP1的构建及免疫效果

用RT-PCR扩增小鼠巨噬细胞源趋化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)基因,与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)VP1基因通过一个编码10个氨基酸残基的接头序列(Gly4Ser)2相连,形成融合基因MDC-VP1,构建真核表达质粒pcDNA3/MDC-VP1,作为疫苗免疫BALB/c小鼠.3次免疫后,pcDNA3/MDC-VP1组小鼠血清中和抗体滴度明显高于pcDNA3/VP1组;而病毒滴度低于pcDNA3/VP1组.用10 LD50CVB3攻击,pcDNA3/MDC-VP1组小鼠生存率为50%,用Kaplan-Meier法进行生存分析,生存率高于其他各组.     

眼眶静脉采血及尾静脉注射给药对大鼠肝细胞内NF-κB的影响

目的研究常规动物实验操作对大鼠肝细胞内核转录因子Kappa B(简称NF-κB)的影响。方法采用雄性SD大鼠,分别进行眼眶静脉采血、尾静脉注射操作,每天记录大鼠体质量和饲料消耗数据,连续处理14 d后,测定各组大鼠肝细胞内NF-κB p65的mRNA表达量和蛋白水平,并与对照组进行比较,分析这些操作的影响。结果与对照组相比,眼眶静脉采血及尾静脉注射实验组大鼠体增重和饲料能耗比均有降低,且差异极显著(P0.01);实验组大鼠肝细胞中NF-κB p65和蛋白的表达水平较对照组都有升高,且差异极显著(P0.01);实验组中眼眶静脉采血组NF-κB p65和蛋白的表达水平高于尾静脉注射组,差异极显著(P0.01)。结论本研究中涉及的常规实验操作均引起大鼠的显著应激反应致福利受损,可导致肝细胞内NF-κB表达水平提高,表明了NF-κB参与了大鼠福利损伤的过程。     

pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射抗肿瘤效应的实验研究

目的研究pEgr-Endostatin辐射诱导肿瘤的表达特性及其抗肿瘤作用,为提高临床肿瘤放疗疗效提供实验证据.方法 Western blotting法检测pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射诱导黑色素瘤B16细胞蛋白表达;建立动物模型,用ELISA法检测不同处理组Endostatin的剂量水平,比较不同处理方式的差异.结果 Western blotting法检测结果显示:重组质粒转染的黑色素瘤B16细胞上清中均有Endostatin蛋白表达,而未转染重组质粒的B16细胞和转染空质粒的B16细胞上清中未见Endostatin蛋白表达.ELISA法检测结果表明:体外接受2~10 Gy X射线照射,Endostatin表达水平明显增加,且照射剂量为4 Gy时Endostatin的表达水平最高.2 Gy照射8~72 h后,Endostatin表达水平与假照射组比较明显增加,在48 h时Endostatin表达水平最高.动物实验表明:荷瘤+25 Gy照射组、荷瘤+pEgr-Endostatin照射组、荷瘤+pc DNA3.1+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin+25Gy照射组肿瘤生长率显著低于单纯荷瘤组(P0.05#0.01),荷瘤+pEgr-Endostatin+25 Gy照射组亦明显低于荷瘤+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin组(P0.05#0.01).结论 pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射能使Endostatin蛋白表达增加,从而抑制血管内皮细胞生长、发挥抗肿瘤作用.