福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法(贝尔曼漏斗法)研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。(1)松材线虫;(2)松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(3)松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(4)松材线虫和非伞滑刃属线虫;(5)松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(6)松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(7)拟松材线虫;(8)拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(9)拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(10)拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(11)伞滑刃属其它线虫;(12)伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(13)非伞滑刃属线虫;(14)无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法.采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测.结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号.表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性.此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005 Pg的松材线虫DNA含量.实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫.     

德国入境松木中锥尾伞滑刃线虫新纪录

宁波出入境检验检疫局植检实验室在1份来自德国的松木质包装材料中截获一种伞滑刃线虫,经形态学观察、测量,以及ITS-RFLP图谱比对,鉴定为锥尾伞滑刃线虫（Bursaphelenchus conicaudatus Kanzaki,Tsuda ＆ Futai,2000）.该线虫属松材线虫组,与松材线虫（B.xylophilus）、拟松材线虫（B.mucronatus）、伪伞滑刃线虫（B.fraudulentus）、豆伞滑刃线虫（B.doui）等比较接近,但其雌虫尾较上述线虫更细长（c′=4.5）,并且明显向腹面弯曲,尾尖突位于腹面,长约2～3μm;雄虫交和伞一般呈卵圆形或铲形.目前该线虫仅日本有报道,在德国尚无记载.作者对其形态特征作了描述,并与4个近似种作了比较.     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，我校森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2h。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DlG—F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。成功设计、合成了TaqMan探针与其配套的引物对F11／R11。     

松树寄生线虫的收集与保存

枯死松树体内寄生线虫种类较多,笔者共收集了线虫资源212个株系.按线虫种类分,包括松材线虫171个株系,拟松材线虫22个株系、霍夫曼尼伞滑刃线虫5个株系、薄荷滑刃线虫1个株系、大核滑刃线虫8个株系、长尾属线虫3个株系以及外滑刃科线虫2个株系,松材线虫收集率为80.7%.按线虫来源分,包括中国线虫198个株系、日本线虫10个株系、美国线虫2个株系、加拿大和韩国线虫各1个株系,中国线虫收集率为93.4%.将212个线虫株系用灰葡萄孢菌培养保存,其中173个株系松材线虫、5个株系拟松材线虫及其他线虫5个株系还采用了DNA-20℃和-80℃保存.这是我国首次大规模保存松树线虫资源.     

越南枯死松树症状特征和体内寄生线虫种类调查

为确定造成越南松林的枯死是否为松材线虫所为,对越南南部的林同省、中部的承天-顺化省、北部的广宁省的思茅松(Pinus kesiya Royle)、马尾松(P. massoniana Lamb.)和南亚松(P. merkusii jungh et de Vries)松树枯死现象及症状特点进行了调查,分别从52株枯死、濒死、健康松树木质部中抽取木质部样品,进行线虫分离,根据形态学特点确定这些松树体内寄生线虫的种类。调查发现松树在枯死过程中,树冠部分针叶失去光泽,逐渐褪绿变黄,进而褐红干枯,最后整个树冠变为褐色或红褐色,全株枯死,针叶下垂且当年不落; 随着病程的发展,松脂分泌逐渐减少,直至停止; 树干上有天牛产卵刻槽,死亡的松树上有天牛的羽化孔。在抽取的松树样品中分离鉴定到了泰国伞滑刃线虫(Bursaphelenchus thailandae)、悬臂伞滑刃线虫(B. gerberae)、中华伞滑刃线虫(B. sinensis)、树木伞滑刃线虫(B. silvestris)、托斯卡纳伞滑刃线虫(B. tusciae)、莱奴尔夫伞滑刃线虫(B. rainulfi)、云杉小蠹伞滑刃线虫(B. rufipennis)和伞滑刃属线虫未定种(B. sp.),调查中未发现重要检疫性病原松材线虫(B. xylophilus)。     

松材线虫和松褐天牛对枯死木的侵染情况调查

松材线虫枯死木的处理是用塑料薄膜密封,并用磷化铝熏蒸。而经过熏蒸处理后的枯死木死否仍会受松褐天牛和松材线虫的侵染,成为松材线虫和松褐天牛的滋生地,这点鲜有报道。我们以松材线虫入侵的林场为研究对象,调查了熏蒸后的枯死木堆薄膜的损坏情况,并检测松材线虫、松褐天牛的侵染,以及枯死木中磷化氢的残留和伐桩蓝变情况,以深入了解处理过的枯死木是否还受天牛及线虫的侵染。检查发现,由于密封用的薄膜老化破裂之后,熏蒸后的枯死木仍然会受到天牛的侵染,且伐桩中也检测到松材线虫,但伐桩树皮在6个月后就没有磷化氢的残留,而伐桩的蓝变率在20%以上,这说明,枯死木仍然能滋生松材线虫和松褐天牛。     

我国松树寄生线虫分类检索

到目前为止,在我国松树体内已经发现有寄生线虫46个已知种和一些未定种。分属于3目9科17属。其中,滑刃目(Aphelenchida)线虫数量最多,包括滑刃科（Aphelenchidae）滑刃线虫属(Aphelenchus)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus),外滑刃科(Ektaphelenchidae)外滑刃线虫属（Ektaphelenchoides）、外真滑刃线虫属(Ektaphelenchus)、隐滑刃线虫属（Crytaphelenchus）,长尾科(Seinuridae)长尾线虫属(Seinura)等,总共40个已知种。垫刃目(Tylenchida)包括粒科(Anguinidae)茎线虫属（Ditylenchus）,伪垫刃科(Nothotylenchidae)柱形垫刃线虫属（Cylindrotylenchus）,纽带科(Hoplolaimidae)拟盘旋线虫属(Pararotylenchus),环科(Criconematidae)小环线虫属（Criconemella）、鞘线虫属（Hemicycliophora）等,共6个已知种。矛线目（Dorylaimida）仅有1个未定种。根据不同目、科、属、种的线虫主要形态鉴定特征,编制了46种松树寄生线虫分类检索表,从而有利于人们方便地鉴定和区分松树寄生线虫.     

松材线虫快速检测试剂盒研制

采用引物对K09F2/R对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测,结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条340 bp的清晰、明亮的条带.而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物.利用引物对K09F2/R构建了松材线虫检测试剂盒.采用该试剂盒可使整个检测过程不超过2.5 h;该试剂盒检测灵敏度为1/7 条线虫,达到了对幼虫成功鉴定的目的,且检测结果便于判读,检测费用较低.     

韩国伞滑刃属线虫的形态和分子特征

以锥尾伞滑刃线虫（Bursaphelenchus conicaudatus）作为对照,在韩国不同地域和寄主中采集了15个松材线虫分离物、3 个拟松材线虫的分离物及5个未鉴定的该属的分离物,并对其进行了ITS 和 D2D3 rDNA序列分析。以单条雌线虫的DNA为模板,ITS 和 D2D3 区由PCR仪扩增并克隆其序列。结果表明,所有松材线虫的ITS 和 D2D3 区序列相同,没有种内变异。然而2个采自黑松和红松的拟松材线虫分离物的基因型分别是亚洲型和欧洲型。5个未鉴定线虫的数据表明,它们分别接近B. tusciae、B. lini、B. thailandae、B. doui和 B. hylobianum,该结果同时被形态学结果所支持。利用5种酶（Hinf I、Alu I、Msp I、Hae III、Rsa）,PCR产物克隆并测序的数据也可以区分不同种和基因型。     

松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

松材线虫病诊断方法研究进展

松材线虫病[Bursa phelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer) Nickle) Nickle]是松树的一种毁灭性病害,也是重要的森林检疫对象。松材线虫病的诊断方法是防止松材线虫病发生、蔓延及传播的技术保证。笔者就国内外对松材线虫病树木诊断方法的研究进行了综述。     

松材线虫体表物质与其携带细菌的关系

松萎蔫病是由松材线虫与其所携带的细菌复合侵染所引起。为进一步明确松材线虫与其携带细菌的关系,笔者用无菌线虫体表浸泡物处理细菌,再将无菌线虫各虫株与细菌共培养,结果表明细菌的存在可促进线虫的繁殖,线虫体表浸泡物质可促进细菌繁殖,无菌线虫与细菌共培养后线虫繁殖数量较无菌线虫单独培养有明显增加,说明松材线虫与其体表细菌的关系为一种互惠关系。此外还设计了无菌线虫对细菌的趋向性试验,考察线虫与自身体表所携带细菌之间的趋向性是否具有特异性,结果表明所有无菌线虫对成团泛菌具有明显的趋向性,各无菌松材线虫对于分离自各自体表的细菌菌株没有特异的趋向性。     

利用松墨天牛早期监测松材线虫病的研究

探索快速检测松墨天牛成虫携带线虫的情况。利用室内松枯死木段中羽化的和FJ—MA—02引诱剂及活虫捕捉器林间诱捕的松墨天牛成虫,用解剖方法和显微镜,对其携带的线虫部位、线虫量和速检做了研究。结果表明;5min后就能检测出其体内有无病原线虫的存在,15—30min后线虫游离率达92．04％-100％。松墨天牛携带线虫率高达44．59％～78．98％,平均为68．63％。在检测有线虫的天牛中,携带线虫量最高为116333条·头^-1,最低为398条·头^-1,平均为10303．85条·头^-1;雌成虫平均线虫携带量（14134．14条·头^-1）高于雄成虫（1366．5条·头^-1）。天牛携带的线虫量以腹部最多,占整个身体线虫量的77．78％以上,平均为82．62％,头胸部线虫量最高仅占25．90％。多年来的研究表明：松墨天牛头胸部有线虫的,其腹部一定也有线虫。因此,在利用松墨天牛成虫预测松材线虫病时,可取成虫含线虫量高的腹部进行分离镜检即可。该方法具有在病害传入早期及时发现和检测时间短等优点。     

松幼苗和幼树离体枝对松材线虫侵染的反应

研究松树幼苗和幼树离体枝对松材线虫侵染的反应,表明组织褐变、失水萎蔫为病害外部症状表现标志;2月龄苗对线虫侵染的反应快速敏感,组织细胞褐变坏死反应明显。而茎已完全木质化的1 年生松幼苗和4~5年生幼树离体枝感染松材线虫后,外部症状表现为发病叶褪绿、变红褐色或褐色且萎蔫,症状首先出现在叶基部,很快向叶尖扩展,至整个针叶枯萎死亡。叶部症状的出现标志病害进入发展晚期,寄主已接近完全死亡,茎内失水和细胞褐变坏死已广泛发生。组织细胞褐变坏死反应则直接与线虫的迁移扩散、分布和数量有关。肉眼可见的皮层和髓的褐变通常发生在线虫出现之后,其褐变程度与线虫的数量呈正相关。     

松褐天牛传递松材线虫数量的研究

松褐天牛从取食开始到试验结束（50d），将松材线虫通过补充营养伤口传递到健康松树，取食到20d时传递的数量最多，每头694条，到第30天数量较多，在此之前和之后数量较少，每头100条左右。松褐天牛将60％的松材线虫传递到当年生树树，随着树枝年龄增加，传递数量减少。实验室和林间试验分离分离测计表明，松褐天牛的身体仍残留一定数量的松材线虫。     

细胞自噬对松材线虫繁殖存活的影响及线虫与松树互作早期自噬相关基因的表达

【目的】细胞自噬在真核生物细胞应对不良环境中具有重要作用。探讨细胞自噬对松材线虫取食繁殖的影响,测定松材线虫与松树互作过程中松材线虫BxATG1和BxATG8两个自噬相关基因的表达。【方法】在前期研究发现松材线虫存在细胞自噬现象,并克隆了松材线虫BxATG1和BxATG8两个自噬相关基因的基础上,采用外源自噬诱导剂探讨了细胞自噬对松材线虫取食繁殖的影响,测定了松材线虫与松树互作早期自噬相关基因的表达。【结果】经雷帕霉素处理后,松材线虫的自噬启动基因BxATG1和自噬标志性基因BxATG8表达量显著上调,且松材线虫的取食速率及繁殖量也显著增加; 松材线虫在饥饿状态下的存活能力明显上升,脂肪含量的堆积也略有增加。松材线虫与松树互作早期(6、12、18、24 h)的qRT-PCR结果表明,松材线虫侵染松树12 h时,细胞自噬爆发达到最高峰。【结论】外源自噬诱导后促进了松材线虫细胞自噬的发生; 细胞自噬在促进松材线虫生长发育中具有一定作用; 在松材线虫侵染松树过程中,细胞自噬有助于线虫适应松树的早期抵抗反应。     

基于GIS的中国松树萎蔫病发生的适应性评价

松材线虫在中国被认为是最具有破坏性和威胁性的外来入侵生物种之一.松材线虫潜在的区域扩散不论是从环境保护的角度还是从经济损失的角度都会对森林生态系统健康的服务功能和美学价值产生很大的影响.在中国存在很多的松材线虫容易感染的寄主植物,其中日本黑松和马尾松已经被证明是最容易感染的树种.媒介昆虫松墨天牛(Monochamus alternatus Hope),是松材线虫病在中国传播的主要媒介昆虫.这种天牛主要分布在河北及河北南部的大部分省份,其大范围存在使松材线虫病在中国更大区域的传播和扩散成为可能.中国大部分地区的温度和积温都适合松树萎蔫病病原线虫和媒介昆虫的大面积发生.利用GIS对传媒昆虫、寄主树木、病原线虫以及气候等空间信息处理和分析,得出松材线虫病在中国有着极大扩散和传播可能,其中广东部分地区、广西和福建部分地区为松树萎蔫病理论上发生最为严重的区域;安徽、江苏、浙江、上海、湖南、湖北、贵州、四川、河南和山东部分地区为松树萎蔫病理论上发生的适宜区.科学的预防和严格的地区间检疫等措施对目前防止松材线虫更大范围内传播很有必要.     

中国江苏、浙江和甘肃与松树相关的线虫种类调查

于2008年5月至11月在中国江苏、浙江和甘肃省进行了与松树相关的线虫种类调查。对马尾松、黑松、湿地松、赤松、油松健康树及病树和死亡树的122个样木进行了检测,将分离到的线虫进行了线虫形态学光镜和扫描电镜的研究。结果共鉴定出5个属的10个种,它们分别是Bursaphelenchus xylophilus Nickle, B. mucronatus, B. aberrans , B. hofmanni, B. sp., Aphelenchoides macronucleatus Baranovskya, A. vaughani Maslen, A. bicaudatus, Ektaphelenchoides pini, Laimaphelenchus sp. Fuchs。大部分线虫发现于死亡或濒死的松树上,只有Aphelenchoides bicaudatus存在于健康黑松树种。Laimaphelenchus sp.存在于油松树皮下,这是该种线虫在中国和Seinura wuae以黑松为寄主的首次记录。     

两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。