松材线虫与拟松材线虫RAPD检测技术

采用RAPD技术对松材线虫和拟松材线虫进行了检测研究,从140个随机引物中筛选出引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18。引物OPK09对12个松材线虫株系扩增出一条约2400bp左右的特异片段,引物组合OPC18 OPN18对10个拟松材线虫株系扩增出一条970bp左右的特异片段。实验表明,引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18具有特异性强、灵敏度高的优点。用这两组引物可以快速、准确鉴定松材线虫和拟松材线虫。     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，我校森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2h。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DlG—F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。成功设计、合成了TaqMan探针与其配套的引物对F11／R11。     

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法.采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测.结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号.表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性.此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005 Pg的松材线虫DNA含量.实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫.     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

松材线虫与拟松材线虫种间杂交特性研究

选取来自中国、日本和美国的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)4个虫株,以及中国的拟松材线虫(B.mucronatus)2个虫株进行生物学杂交和交配对象选择试验。结果表明:松材线虫和拟松材线虫的部分虫株可以发生种间杂交,正交总交配成功率为4.2%,反交总交配成功率为10%,反交成功率是正交的2倍。杂交整体发生率极低,杂交后代较难形成可持续的繁殖种群。采用松材线虫(简称Bx)/拟松材线虫(简称Bm)快速分子检测系统对杂交F1代幼虫进行分子鉴定,结果表明F1代幼虫既含有Bx分子标记也含有Bm分子标记。继代培养30 d后,杂交后代在基因型上表现出了不同趋向的分化,其中BxAN5♀×Bm JNL1 ♂、BxAN5 ♂×BmAN5♀和BxUSA ♂×Bm JNL1♀的杂交后代趋向于成为松材线虫占主导的种群,BxJNL5 ♂×BmJNL1♀的杂交后代趋向于成为拟松材线虫占主导的种群。在有种内交配资源存在情况下,无论松材线虫还是拟松材线虫均倾向于优先选择种内交配资源。研究表明松材线虫和拟松材线虫之间存在一定的生殖隔离,自然状态下种间交配可能会产生,但杂交后代较难形成可持续性繁殖的生殖后代。     

黑松与松材线虫和拟松材线虫互作早期超氧自由基研究

为探讨黑松受不同毒力松材线虫与无毒拟松材线虫侵染后,超氧自由基(O2.-)在互作早期对松材线虫病发生发展的作用,采用2年生黑松接种强毒、弱毒松材线虫与无毒拟松材线虫,于接种后4、12、24、48、72、96、120 h对受侵染黑松的茎干和针叶取样测定。结果表明:黑松受不同毒力供试线虫侵染后体内O2.-和SOD活性变化差异显著。接种后12 h,松树茎、叶中的O2.-均出现第1次突增,茎部突增的强度与供试线虫毒力呈负相关,在针叶内O2.-出现第2次突增,且无毒拟松材线虫处理(48 h)的启动时间早于强毒松材线虫(72 h)的。SOD活性在接种无毒拟松材线虫的松树茎、叶中出现两次突增,而接种强毒松材线虫的处理仅出现1次突增。3种处理黑松茎、叶的Mn-SOD含量在24 h后第1次突增,且接种无毒拟松材线虫的高于接种强毒松材线虫的。O2.-与SOD的变化趋势在一定程度上呈正相关关系,但SOD的特异变化滞后于O2.-的变化。由此可见,超氧自由基可能是松树受松材线虫侵染后进行信号转导的重要桥梁物质。     

松材线虫和拟松材线虫种间及种内遗传相关性的RAPD分析

运用RAPD技术对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行随机扩增,聚类分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。拟松材线虫群体亦可分为两亚组:一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,二为韩国和中国湖南虫株。     

松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

细菌XSJS3对松材线虫杀线活性的测定

细菌XSJS3是一种新发现的对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的细菌,试验比较了细菌XSJS3培养液、细菌培养液滤液及含菌体水溶液对松材线虫的杀线活性,结果发现细菌菌体本身对松材线虫无杀线活性,杀线活性物质存在于细菌的培养液滤液中。通过对该细菌培养液滤液对松材线虫致死过程的观察发现:松材线虫接触该细菌培养液滤液30min后就表现为行动迟缓;在5h后所有虫体均不活动,针刺无反应;24h后部分僵直虫体出现局部膨大,且膨大部位出现体液外渗而虫体最终被消解。对不同培养时间的细菌XSJS3滤液杀线活性的比较试验表明:该细菌分泌的杀线物质在10d内随培养时间的延长而含量增加,杀线活性逐渐提高,不同培养时间下滤液的杀线活性差异明显;但培养15d后,稀释10倍的滤液对松材线虫杀线活性比培养10d时同样滤液的杀线活性则略有下降,但差异不明显,因此获得该细菌分泌的杀线物质较理想的培养时间为10d。将细菌XSJS3培养液滤液进行不同温度的热处理后测定对松材线虫的杀线活性,结果表明引起松材线虫死亡和消解的物质是两个不同物质,存在于培养液滤液中的对松材线虫有杀线活性的物质是热稳定的,而引起松材线虫虫体消解的物质是热不稳定的。     

松材线虫在抗性黑松体内移动及寄主水势变化

以接种松材线虫的1年生抗性黑松苗为实验材料,用感病黑松苗作对照来研究松材线虫在抗性黑松体内的移动及寄主水势变化.结果表明:接种初期,松材线虫在树体内的数量少,移动速度慢;在抗病黑松体内,线虫主要向下移动,且虫体数量明显少于在感病黑松体内的数量;在感病黑松体内线虫自接种点向上、下移动,且向下移动的速度和虫体数量明显大于向上的.随着时间的推移,线虫开始繁殖,扩散能力增强.水势测定结果显示,感、抗病黑松水势变化总趋势是先上升后下降再上升.     

两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。     

细菌JK JS3对松树线虫的杀线活性及菌种的分子鉴定

分离自马尾松的细菌JK JS3是对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的拮抗细菌,为了解该菌株对松树体内其他植物线虫的杀线活性并验证经形态学和Biolog方法得到的菌种鉴定结果,笔者测定了该细菌培养滤液对大核滑刃线虫(Aphelenchoides macronucleatus)等7种松树体内植物线虫的杀线活性,并对该菌株的16SrDNA基因进行了扩增测序和比对分析。结果表明：该菌株培养液原滤液对测试线虫24h的杀线率均达到了100%,说明该细菌的杀线谱较广,但培养滤液的不同倍数稀释液对不同种线虫的杀线活性有显著差异,10倍稀释液对霍夫曼尼伞滑刃线虫(B.hofmanni)的杀线活性最高,杀死率为96.9%;其次对李氏长尾线虫(Seinura lii),杀死率为73.7%;再次对松材线虫和拟松材线虫(B.mucronatus),杀死率分别为48.7%和39.0%。而对大核滑刃线虫、吴氏长尾线虫(S.wuae)和外滑刃科线虫(Ektaphelenchidae sp.)的杀死率较低,分别为15%、1.5%和0;该菌株的16SrDNA基因序列BLAST比对结果表明,该菌株与菌株Bacillus amyloliquefaciens FZB42最为接近,相似性为99.86%,处于系统发育树的同一分支,进一步验证了其形态学和Biolog细菌鉴定仪的鉴定结果,确定该菌株的分类地位为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

利用愈伤组织验证细菌分离物B619与松材线虫病的关系

用细菌分离物B619、无菌松材线虫以及它们的混合物接种黑松愈伤组织,发现无菌线虫或B619单独接种的黑松愈伤组织表现为轻微褐变;二混合接种的黑松愈伤组织严重褐变、萎缩、表现高度感病;而二得混合接种的预先用抗菌素处理的愈伤组织发病较轻。这些结果与接种黑松幼苗的结果相似,再次证明了松材线虫病是一种由松材线虫和细菌共同侵染引起的复合侵染病害。在愈伤组织中单独接种B619,接种后其数量逐渐下降,而在愈伤组织中混合接种,B619繁殖很快,其数量呈上升趋势,表明在愈伤组织内松材线虫的存在有利于B619的繁殖。     

不同真菌对松材线虫繁殖及致病力的影响

利用3年生黑松为接种材料,研究在9种不同真菌上取食的松材线虫的繁殖和致病力变化。结果表明,真菌对松材线虫的繁殖和致病力有显著影响。松材线虫在9种真菌上取食后,松材线虫繁殖力和致病力从大到小而依存的真菌依次为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)、盘多毛孢(Pestalotia sp.) 、拟茎点霉(Phomopsis sp.)、茎点霉(Phoma sp.)、头孢菌(Cephalosporium sp.)、交链孢(Alternaria sp.) 、炭疽菌(Colletotrichum sp.)、长喙壳(Ceratocystis sp.)。实验表明松材线虫的繁殖力与其致病力变化相一致。     

禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒比对结果分析

对6种禽流感病毒通用型荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),PCR检测试剂盒进行比对与科学评价,为实验室采购提供依据。利用禽流感病毒H5、H7、H9亚型标准品,鸡新城疫活疫苗与传染性支气管炎活疫苗对市售的6种品牌(分别记为A、B、C、D、E、F)禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒灵敏性与特异性进行了比对,并对97份临床样品进行了检测,筛选出禽流感病毒通用型最佳检测试剂盒。结果表明:A厂家试剂盒最低可检出1:100倍稀释的H7亚型标准品浓度,B厂家试剂盒最低可检出1:1倍稀释的H7亚型标准品浓度,C厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,D厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,E厂家试剂盒最低可检出1:1 000倍稀释的H7亚型标准品浓度, F厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,6种试剂盒特异性均良好。综上,E厂家试剂盒优于其他厂家试剂盒,可以作为动物疫病检测实验室在实施监测任务中的首要选择。     

不同致病力线虫侵染后黑松的水势和根系活力的变化

分别用强、弱致病力松材线虫虫株和无致病力拟松材线虫虫株接种2年生黑松,观测接种后不同时间段黑松茎段水势和根系活力变化情况。结果表明：接种强、弱致病性松材线虫虫株后,在未表现出明显症状时,黑松水势都有一个降低然后回升的过程,但当树体内线虫开始大量繁殖、外部表现萎蔫症状时,黑松水势发生不可逆转的急速降低,松树死亡,强致病性松材线虫虫株比弱致病性松材线虫虫株导致黑松茎水势丧失速度快。接种无致病力拟松材线虫后,开始黑松水势下降,然后缓慢回升接近正常水势,随着线虫的死亡,树体水势恢复正常。接种3种线虫虫株后,黑松根系活力随着线虫的侵入都有一个升高的过程,接种强、弱致病力松材线虫虫株后,黑松出现萎蔫时,根系活力虽然有所下降,但仍然保持较好的根系活力,直到松树干枯后根系活力才丧失,这与干旱胁迫下,植物首先丧失根系活力然后表现萎蔫不同;接种无致病力拟松材线虫后,随着拟松材线虫在黑松体内的死亡,黑松的根系活力在升高后逐渐恢复正常。