极端嗜热厌氧纤维素分解菌基因文库的构建及其内切葡聚糖酶基因片段的克隆

以从云南邦拿掌温泉中分离、纯化的高温厌氧纤维素分解菌邦2菌(Cadicellulosiruptor)为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经EcoRⅠ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因文库,经筛选鉴定得到6.3×103个重组子;重组子经刚果红平板验证:约有23.5%菌落呈现透明圈;重组子经EcoRⅠ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段.结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的内切葡聚糖酶基因(ED基因)片段.     

DDR相关蛋白缺陷引起的原发性免疫缺陷表型研究进展

在细胞内可变区基因(多样化基因)连接区基因片段重组(variable(diversity)joining recombination,V(D)J)与免疫球蛋白的类别转换重组(class switch recombination,CSR)过程中会产生程序性DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB).当检测到DSB发生时DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)被启动.DDR缺陷的病人具有原发性免疫缺陷表型(primary immunodeficiency,PID).总结了V(D)J重组与CSR产生DDR的分子机制,综述了V(D)J重组与CSR过程中DDR相关蛋白缺陷引起的原发性免疫缺陷表型.     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。     

降解结晶纤维素极耐热葡聚糖酶重组菌的构建

极耐热纤维素酶在纤维素生物转化中具有潜在的开发前景,但极耐热酶缺乏对天然纤维素的分解能力。采用基因工程方法,将极耐热内切葡聚糖酶Cel12B基因和同样极端嗜热菌来源的纤维素结合域(CBD)区域融合,构建重组质粒pET-20b-Cel12B-CBD,转化至大肠杆菌JM109(DE3)诱导表达后,融合基因表达产物对结晶纤维素具有一定的分解能力。     

人乳铁蛋白阳离子多肽重组Taq DNA聚合酶的研究

本文报道了人乳铁蛋白阳离子多肽(HL-N)替换Taq DNA聚合酶N-末端结构域,构建新型重组Taq酶的研究结果.利用合成寡核苷酸,成功获得具DNA合成功能的HL-N重组Taq酶.对该重组酶的DNA合成加工、血清耐受性等测试显示,HL-N重组Taq DNA聚合酶的DNA扩增速度、扩增物产量、以及对反应体系中血清浓度的耐受性都得到显著提高.     

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

人参DNA限制片段在酵母菌中的转化

用YRp7质粒作载体,AH_(22)作受体株,将YRp7质粒和人参DNA限制片段构成的重组体转入AH_(22)中,并由大量培养的AH_(22)细胞中回收到YR_(p7)质粒和人参DNA限制片段,表明人参DNA限制片段可转入酵母菌中。     

医药基因工程产品的研究与开发

基因工程(亦称遗传工程)主要运用DNA重组技术,在特殊酶的作用上,在体外人工连接来自不同生物体的目的基因于有自主复制能力的载体的DNA中,建成重组DNA的质粒,再将此重组质粒传入受体生物细胞中去扩增和表达,达到遗传物质的转移,产生高纯度所需多肽和蛋白质。显然,基因工程的主要目的是按意图生产基因产物;此外,还有制取某些DNA片段和DNA探针,用于基因诊断和治疗;以及通过输入、替代     

生物素标记的PSTV互补DNA探针分子杂交的研究

用~(32)P标记的互补DNA探针进行分子杂交是基因重组和分子克隆中常用技术,然而由于~(32)P的半衰期短,从而为供应和保存带来不便,致使这一技术的应用受到一定限制。近年来国内外均十分重视研究应用非同位素标记DNA探针的技术。我们用Biotin—11—dUTP(Bethesda Research Laboratories)以缺口平移(Nick translation)标记了pST-B14和pST-B5 DNA中的PSTV cDNA插入顺序,制备出生物素标记的DNA     

构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.     

构建重组人CatSper1特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-599)原核表达载体并表达重组抗原。方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体。测序鉴定后转化工程菌株E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白。用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况。结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原。结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsper1特异抗原。     

某些缠绕方程组的解

利用纽结理论和缠绕模型来研究环状DNA分子在酶(如拓扑异构酶和重组酶)作用机制下的变化,揭示了其在酶促反应过程中如何断开原有结构并改变端点进行重组,从而改变其拓扑结构的.在整个DNA分子重组实验过程中,相当于进行了一次缠绕手术,用新的缠绕取代了被删除的缠绕,因此研究并分析在此过程中抽象出的缠绕模型显得十分重要.给出某些缠绕方程组的解,从而给出了DNA分子重组的数学模型.     

杜氏藻DNA酶活性比较研究

杜氏藻(Dunaliella,常称盐藻)是一属耐高盐度的单细胞绿藻,生长迅速,不具纤维素细胞壁,是基因工程潜在的DNA(基因)受体,而其DNA酶活性高低是衡量能否作为受体细胞的重要指标,越低越好。本研究中,DNA酶指能降解DNA的多种酶的总称。 采用三聚乙醛-二苯胺法分别测定了杜氏藻属6个种的DNA酶活性。从测定结果(Tab.1)看出,杜氏藻细胞的DNA酶活性偏低,并且不同种之间存在明显差异。其中D.minuta,     

醋渣纤维素降解菌的筛选鉴定及混合菌系的构建

以包头市呱呱叫调味品厂醋渣为菌源,采用纤维素刚果红培养基、滤纸条崩解试验初筛得到3株降解纤维素活性较高的菌株;采用不同混合菌对醋渣进行固态发酵,考察醋渣的降解率及滤纸酶活性变化。结果表明,H2+H4混合菌对醋渣的降解率最高;采用16Sr DNA、18Sr DNA序列分析方法对3株菌进行鉴定,菌H2为产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、菌H4为卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)、菌H16为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。     

中国明对虾CrusFc-2基因的重组表达及抗血清制备

利用PCR和DNA重组技术克隆了中国明对虾CrusFc-2基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-CrusFc-2原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到了重组蛋白.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,Western Blot分析表明Crus...     

重组人促性腺激素对小鼠排卵影响的机理

探讨不同剂量和组合的重组人促性腺激素对小鼠卵泡发育和排卵的影响及其与小鼠血清中雌、雄激素水平变化的相互关系.实验采用DNA重组技术合成的重组人促性腺激素对性成熟前雌性昆明白小鼠(22～24日龄)以不同剂量和组合进行超数排卵处理,结果表明,一定剂量和组合的重组促性腺激素的处理对小鼠卵泡的发育和血清中雌、雄激素水平产生较大影响,卵泡的正常发育及最终的排卵要求一定的重组人卵泡刺激素(r-hFSH)、重组人促黄体生成素(r-hLH)、重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的配比组合和相应的剂量范围.重组促性腺激素处理后小鼠卵泡的发育和排卵与雌、雄激素生成的量有关.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coli BL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E．coli BL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS—PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33．4kD,约占菌体总蛋白29．4％．     

体外定向分子进化的新策略及新应用

体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法,提供了一种高效的获得多样性的方法。DNA改组(DNA shuffling)是重要的体外分子进化技术,结合高通量筛选能够改造许多重要的医药、工业、环境保护等方面的商业酶。近年来,许多体外分子进化的新策略和新方法层出不穷,得到了良好的发展和应用,其中有代表性的11种是DNA家族改组(DNA family shuffling),部分基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、基因组改组(Genome Shuffling)、瞬时模板的随机嵌合(RACHITT)、单向引物的随机重组(MURA)、自我复制(CSR)改组、易错环行扩增(error-prone RCA)、基于遗传密码随机切除(COBARDE)、核酸内切酶V(endonuclease V)替代核酸内切酶DNaseI等。     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.