Broad host range plasmid-based gene transfer system in the cyanobacterium Gloeobacter violaceus which lacks thylakoids

Gloeobacter violaceus, a cyanobacterium lack of thylakoids, is refractory to genetic manipulations because its cells are enveloped by a thick gelatinous sheath and in colonial form.In this study, a large number of single cells were obtained by repeated pumping with a syringe with the gelatinous sheath removed.And an exogenous broad host range plasmid pKT210 was conjugatively transferred into G.violaceus.Analyses with dot-blot hybridization and restriction mapping showed that the exogenous plasmid pKT210 had been introduced into G.violaceus and stably maintained with no alteration in its structure.pKT210 extracted from G.violaceus exconjugants could be transformed into the mcr- mrr- E.coli strain DH10B but not the mcr+ mrr+ strain DH5α, which suggests that a methylase system may be present in G.violaceus.     

筛选甘蔗SPSⅢ启动子诱饵片段结合蛋白的酵母单杂交诱饵质粒的构建

主要构建了可以与酵母染色体发生重组的质粒pAbAI-Bait,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获得转化子,将阳性克隆进行PCR与DNA测序的方法鉴定,结果表明: 酵母单杂交中报告质粒pAbAI-Bait构建成功,可用于酵母单杂交体系.     

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG -pPIC9K的嗜甲醇酵母     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

枯草芽孢杆菌高效转化及其转化子验证方法

用构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600感受态细胞,进行不同时间预培养后,涂布于抗生素平板培养,研究一种更高效的转化方法。用载体与外源片段的连接产物转化WB600感受态细胞,进行最佳预培养时间培养后,涂布于抗生素平板培养,培养得到的转化子用PCR快速验证和双酶切鉴定,研究一种转化子的快速验证方法。     

PARP抑制剂诱导外源整合基因删除的作用特点

构建能表达LacZ基因和c-Ha-T24ras基因的两种真核表达重组质粒A13.4和B12.7（两基因相对位置不同），并将其转染NIH3T3细胞和HeLa细胞，经G418筛选，分别建立了四种稳定转化细胞系A13.4-NIH3T3、B12.7-NIH3T3、A13.4-HeLe及B12.7-HeLa。用聚ADP核糖聚合酶（PARP）的NAD位点抑制剂苯甲酰胺（BA）分别处理四种转化细胞后，检测细胞中整合的外源LacZ基因与c-Ha-T14ras基因的删除情况，结果如下：BA诱导的基因删除可发生于NIH3T3转化细胞系，但不能发生于HeLa转化细胞系；位于同一外源表达载体上的LacZ基因与c-Ha-T24ras基因的删除过程是同步的；外源整合DNA片段的转录强度可能直接影响其被BA诱导删除的敏感性。     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大...     

小鼠嗅鞘细胞的分离、纯化和免疫细胞化学特性

目的:对小鼠嗅鞘细胞的体外分离、纯化和免疫细胞化学特性进行研究.方法:分离新生小鼠嗅鞘细胞,综合运用差速贴壁法、阿糖胞苷抑制和丝裂原刺激等方法对其进行纯化,并用免疫细胞化学方法对其进行检测.结果:体外培养的新生小鼠嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞.纯化培养后其纯度可以达到88.7%以上,污染细胞中有星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞和成纤维细胞.免疫组化结果提示,嗅鞘细胞呈P75和CNP免疫阳性,GFAP和Nestin阴性.结论:本研究对新生小鼠嗅鞘细胞的形态学和免疫细胞化学特性提供了部分数据.但不同的取材时间,不同的培养条件对嗅鞘细胞的影响尚需进一步研究.     

改进RBB染色法初步筛选几丁质酶基因chiA的表达

对RBB(Remazol Brilliant Blue)底物染色方法进行产几丁质酶细菌的酶活性筛选,应用几丁质胶体平板诱导表达的筛选取得好的效果.粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA在E.coli中的异源表达过程:首先从质粒pMD-chiA(DH5a)中切出含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的片段,将其插入到表达载体pET-22b( )内,构建成几丁质酶表达质粒pET-chiA.然后,转化进入DH5a感受态细胞内,鉴定正确后将pET-chiA质粒转入BL21(DE3)pLySS中进行表达,并进行初步筛选.     

三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化

描述了一种改良的高效细菌感受态的制备和感受态细胞的保藏及细菌的转化方法.三种不同的大肠杆菌分别是DH5α,TG1和XL1blue,其中最有效的是XL1blue.每种菌株的感受态细胞制备的最佳光密度(OD600值)不同.对感受态细胞的存储时间及其与转化效率之间的关系也进行了研究,结果显示感受态细胞可以在-20℃存储7d,在-70℃存储15d.将常见的方法做了三种改进:首先是将CaCl2溶液改为TB溶液;其次是将培养基由LB换成S.O.C;再就是在质粒对感受态细胞的转化过程中加入DMSO或PEG8000.改良的细菌转化系统比常见的方法能提高转化效率约1000倍,是一种高效的细菌转化系统.     

异戊烯基转移酶基因克隆及植物表达载体构建

根据已知的异戊烯基转移酶基因保守序列设计引物,以根癌农杆菌C58的Ti质粒为模板,采用PCR方法扩增获得了异戊烯基转移酶基因723bp的片段.将该片段回收,连接到pMD18-T载体测序,测序片段经酶切回收后克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α.将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105,经菌液和质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-ipt,这为异戊烯基转移酶基因功能的进一步研究提供了基础.     

IGF-Ⅱ在原核生物中的表达

胰岛素生长因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在机体的许多组织中都有表达,具有促进细胞生长和分裂等的多种生物学功能。在本研究中,我们采用RT-PCR法克隆和扩增到了IGF-Ⅱ基因,通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到了pET21b-IGF-Ⅱ重组质粒载体,然后将其转化DH5α中,经IPTG诱导后表达的重组蛋白经纯化,并用Western blot检测,显示重组质粒pET21b-IGF-Ⅱ编码一个约25kD的外源蛋白。     

脂筏特异蛋白荧光标记及在PC12细胞中的功能

采用PCR技术从小鼠cDNA文库中扩增出编码caveolin-1和flotillin-1基因片断,通过TOPO载体将基因克隆到表达载体pEGFP,转化至大肠杆菌DH5α中,抽提、纯化后将重组质粒转入PC12细胞中表达,用TIRFM观察高K 刺激下胞内标记蛋白的动态分布情况.实验结果显示重组质粒caveolin-1-pEGFP和flotil-lin-1-pEGFP在PC12细胞中具有一定的功能,而且caveolin-1和flotillin-1在发挥功能时可能有一个向膜转运的过程.     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.     

大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基的克隆、表达、纯化及包涵体的复性

利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取酒石酸脱氢酶β亚基基因(TtdB),并将之克隆到质粒pUC18上,转化大肠杆菌DH5α细胞.经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和双波长扫描分析,确定酒石酸脱氢酶β亚基在大肠杆菌中表达时以包涵体形式存在.目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性.复性产率可达90%.     

一种酿酒酵母同源重组载体的筛选

将携有mTn-3xHA／LacZ转座子的酿酒酵母文库质粒pHSS6转化大肠杆菌DH5α,挑取单菌落并提取其质粒．将纯化质粒分别用Not Ⅰ酶切后,转化尿嘧啶缺陷型(ura^-)酿酒酵母菌株INVScl,使其同源重组到酿酒酵母基因组中,于SC／ura^-平板上筛选．取长有单菌落酵母的平板进一步筛选重组后上游有强启动子酿酒酵母文库质粒,用近300个质粒转化酵母菌株INVScl,最终得到2株前端有强启动子的酿酒酵母质粒,这2个质粒可作为酿酒酵母同源重组载体广泛应用．     

分泌性BACE1蛋白在昆虫细胞的表达

为了获得有活性的重组β-secretase并研究其功能,寻找特异性抑制剂,应用RT-PCR技术,从人胚胎脑组织特异性扩增并克隆了人BACE1编码基因的胞外片断(BACE1-454)。测序后与质粒pFastBac连接,得到含BACE1-454基因的重组质粒pFast-BACE1-454。将其转化到含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对重组穿梭载体Bacmid-BACE1-454进行鉴定。将Bacmid-BACE1-454经脂质体介导转染Sf9细胞,收获病毒。用重组杆状病毒颗粒感染昆虫细胞,表达蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性。     

分泌载体pPSA18的构建及地衣杆菌淀粉酶在枯草杆菌中的表达和分泌

本文报道利用枯草杆菌噬菌体Spol 的启动子Spac Ⅰ,合成的解淀粉芽胞杆菌信号序列及枯草杆菌质粒PUB 18重组,构建分泌型表达载体并将地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因(缺失启动子及信号序列)引入构建的载体,获得重组质粒pPSA 18.将此质粒转化枯草杆菌QB1130(amy~-)感受态细胞,在含5μg/ml 卡那霉素及1%可溶性淀粉的LB 平板上筛选Km~r 及淀粉酶阳性的转化子.从阳性转化子中提取质粒,经酶切分析后重新转化枯草杆菌QB1130,得到的转化子全部都能向胞外分泌淀粉酶,证明构建的载体能在枯草杆菌中表达和分泌外源基因产物.     

优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究

通过研究不同生长状态、处理溶液、保存时间及热激时间对感受态细胞制备的影响,分析了影响大肠杆菌株JM109和DH5α感受态细胞形成因素,优化了制备感受态细胞的方法.结果表明,OD600为0.43的大肠杆菌菌液经处理液(20 mmol/L MgCl2 + 80 mmol/L CaCl2)处理,-85℃放置12～14 h,42℃热激处理90 s,转化效率最高,可达5.5×105～6×105 cfu/μg DNA(pSilencer2.1-U6-neo),随着质粒放置时间增加,转化效率下降.