产几丁质酶菌株的分离与鉴定及产酶条件优化

从土壤中分离到一株产几丁质酶的细菌LL-C.该菌经16S rDNA序列同源性分析及形态培养特征、生理生化特征分析,鉴定为Luteibacter rhizovicinus,属于黄单胞菌科(Xanthomonadaceae).以不同发酵时间、碳源、氮源、起始pH值、培养基装液量和培养温度为因素,考察LL-C菌株产几丁质酶的优化条件.结果表明,最有利于该菌产几丁质酶的条件:碳源为胶体几丁质、氮源为(NH4)2SO4,培养基起始pH值为4.5,培养基装液量为30 mL,培养温度为32 ℃,振荡培养时间为7 d,此优化条件下,摇瓶产酶活力为115.02 μkat·L-1.     

嗜麦芽窄食单胞菌产生的几丁质酶的特性

从土壤中筛选出一株产几丁质酶的革兰氏阴性细菌,通过16S rDNA法对酶活力最高的菌株C进行鉴定,确定为嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)菌株.通过单因素优化法和均匀设计法确定S.maltophilia产几丁质酶的最佳条件:在pH值为7.0的基础培养基中添加质量分数为1.0%的酵母膏、质量分数为0.5%的胶体几丁质,于180 r·min-1,30 ℃的摇床中培养60 h.对硫酸铵沉淀获得的粗酶进行酶学性质研究,结果表明,该几丁质酶的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH值为7.2,在55 ℃以上的温度条件下容易失活.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,确定S.maltophilia几丁质酶的相对分子质量为6.8×103;以筛选的S.maltophilia菌株的总DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增出几丁质酶DNA测序;应用生物信息学手段推导S.maltophilia几丁质酶为分泌型蛋白酶,预测其等电点pI值为5.42,相对分子质量为6.8×103(与实验纯化的酶蛋白电泳结果一致).预测该酶氨基酸序列具有信号肽区(氨基酸残基1～41)、Ⅲ型几丁质结合区(残基47～92)、多囊肾病域(107～194)、类纤维连接蛋白Ⅲ型区(Fn3,201～278)和18家族糖基水解域等5个结构功能区,5个区域被富含Ala,Gly,Pro,Ser和Thr的短序列连接起来;在第400～500个氨基酸残基间有一个螺旋结构.     

改进RBB染色法初步筛选几丁质酶基因chiA的表达

对RBB(Remazol Brilliant Blue)底物染色方法进行产几丁质酶细菌的酶活性筛选,应用几丁质胶体平板诱导表达的筛选取得好的效果.粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA在E.coli中的异源表达过程:首先从质粒pMD-chiA(DH5a)中切出含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的片段,将其插入到表达载体pET-22b( )内,构建成几丁质酶表达质粒pET-chiA.然后,转化进入DH5a感受态细胞内,鉴定正确后将pET-chiA质粒转入BL21(DE3)pLySS中进行表达,并进行初步筛选.     

重组产几丁质酶C工程菌包涵体的复性

将重组产几丁质酶C(Chi C)的菌体通过固定金属鳌合层析(IMAC),对目的蛋白进行初步纯化;然后采用透析法、凝胶过滤柱层析法和金属鳌合柱层析法对包涵体进行复性.结果表明,逐渐降低变性剂尿素浓度进行透析复性,酶液的酶活力为58.85 μkat·L-1,比活为0.425 mkat·g-1,蛋白回收率为95.3%.使用S...     

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.