土壤产几丁质酶菌株的筛选鉴定及产酶条件

利用几丁质为碳源,从土壤中筛选出3株产几丁质酶菌株,其中酶活最高的为一株革兰氏阴性菌.对该菌株应用16S rDNA法进行鉴定,结果为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia).通过单因素优化法和均匀设计法实验,结果表明,以质量分数0.5%的胶体几丁质为碳源,质量分数1.0%的蛋白胨为氮源,及30℃和pH值为7.2,发酵60 h的条件是菌株的最合适产酶条件.此时,胞外几丁质酶酶活力最高.     

南海海域几丁质降解菌的筛选及其特性研究

从南海海域水样和沉积物中分离并筛选到两株几丁质降解菌,分别为SCSS04和SCSWE13.16S rDNA序列分析结果表明,菌株SCSS04属于芽孢杆菌属,菌株SCSWE13属于弧菌属.两株菌几丁质酶的产生均需要几丁质的诱导,并在富营养培养基中产酶量较高.菌株SCSS04在培养第9天产酶量达到最高,所产生的几丁质酶最适反应温度为40～50℃.菌株SCSWE13属于低温酶,在培养第7天产酶量达到最高,所产生的几丁质酶最适反应温度为20～28℃.     

冷活性琥珀酸脱氢酶的特性

用常规酶学方法从嗜冷酵母(Y18)中分离纯化有催化活性的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH).该酶的最适反应温度为20℃,0℃仍然保持酶活性的20%,40℃处理30min酶活性损失90.4%,不同温度处理后酶在280nm的紫外吸收明显改变,随温度升高在280nm紫外吸收值增大.这些结果表明所分离到的SDH是对温度敏感的冷活性酶.纯化的SDH经PAGE电泳分析显示单一条带,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测出相对分子质量为60×103和32×103的2条带,分别为黄素蛋白(flavoprotein, FP)大亚基和铁蛋白(iron-protein, IP)小亚基.通过对FP的1491个碱基的DNA序列分析表明(酿酒酵母FP基因全序列由1923个碱基组成),菌株Y18与酿酒酵母具有很高的DNA序列同源性;Y18与酿酒酵母FP一级结构包括酶的活性中心基本一致,但Y18的FP中3个位置的氨基酸变为R基较小的氨基酸,并有3个位置的氨基酸被在β-转角处出现频率较高的氨基酸所取代(丝氨酸、天冬氨酸和苏氨酸).这些结构特性可能使Y18 SDH的空间结构更具柔韧性(flexibility),有利于在低温条件下发挥催化功能.     

重组粘质沙雷氏菌几丁质酶C的纯化及酶学性质

为从已构建的重组大肠杆菌pET-22b-chiC获得高纯的几丁质酶C,通过降低培养温度,提高粘质沙雷氏菌几丁质酶C的可溶性表达.表达产物经镍柱亲和层析(IMAC)和Phenyl-Sepharose疏水层析(HIC)分离纯化后,得到电泳纯的几丁质酶.酶学性质研究表明,纯化的几丁质酶C为单体蛋白,相对分子质量为51.8ku;最适pH值为5.0,最适温度为55℃,在55℃的条件下保温4 h后仍有90%以上的酶活力.研究结果还表明,Cu2+,Hg2+,Co2+,Mg2+对酶活力均有明显抑制作用,而Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+对酶活力有一定促进作用,Mn2+对酶活力明显促进作用.     

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.     

绿色木霉CBHⅡ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

采用反转录聚合酶链式反应的方法从绿色木霉中克隆得到纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)的编码基因cbh2.将该基因片段接入酿酒酵母整合型表达载体pScIKP中,得到重组质粒pScIKP-cbh2.电转化酿酒酵母菌株,通过G418浓度梯度筛选出高抗转化子.采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测CBHⅡ蛋白的表达,并采用羧甲基纤维素糖化力法检测重组CBHⅡ的酶活.实验结果表明:该基因大小为1416bp,编码有472个氨基酸残基,并已将序列提交GenBank,登录号为 DQ864992.SDS-PAGE分析发现重组CBHⅡ成功分泌到了胞外,其相对分子质量约为70000.培养液中的酶活最高可达7.71U/mL,其作用的最适pH值为5.0,最适反应温度为65℃,且具有较好的热稳定性.     

微泡菌ALW1几丁质酶Chi18A的克隆及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.)ALW1的基因组为模板,利用几丁质酶基因的特异性引物进行PCR扩增,然后将产物插入到pMD18-T载体后进行DNA序列测定,并对目的基因编码的蛋白质序列进行信息学分析。结果显示,克隆的目的基因大小为1644 bp,预测编码含有547个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的几丁质酶序列具有70%左右的相似性,表明预测目的基因编码几丁质酶。该蛋白质具有2个几丁质结合结构域和1个GH18家族酶的催化结构域,属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)家族18,命名为几丁质酶Chi18A。模拟的三维结构显示,Chi18A含有(βα)_8桶状结构。     

海洋链霉菌产生几丁质酶的研究

从闽南地区潮间带红树林根际海泥中分离到能产生几丁质酶(Chitinase)的放线菌(Actinomyces)300余株,研究了各种诱导物、碳氮源及培养条件对链霉菌S-128(Streptomyces sp.S-128)菌株几丁质酶生物合成的影响,结果表明,该菌株几丁质酶的合成能被多种几丁质所诱导,是一种诱导酶,添加氮源尤其是有机氢源能促进酶的合成,而碳源却没有这种作用,基本培养基中加入2.O％脱矿质几丁质和1.5％玉米浆,在28℃发酵5d,发酵液的几丁质酶活性可达290u/ml,该酶对几丁质的水解反应显出较宽的pH范围(pH3～8)和较好的pH稳定性,最适pH5.0,在一定的温度范围内,该酶的活性随温度的上升而增高,并以65℃的酶活性最高。     

产碱性冷适蛋白酶菌株Chryseobacterium sp.vv8的鉴定及粗酶性质

为鉴定金黄杆菌属(Chryseobacterium)菌株vv8及分析其胞外蛋白酶的酶学特性,首先,通过分子及生理生化特性对菌株vv8进行鉴定;然后,采用明胶平板筛选法和Lowry法对菌株vv8进行产酶筛选和蛋白酶活性测定;最后,研究pH值、温度、金属离子和抑制剂对该蛋白酶活性的影响.研究结果表明:菌株vv8的16S rDNA与比目鱼黄杆菌(C.scophthalmum)具有98.24%的序列相似性,属于Chryseobacterium属;菌株vv8的最适生长条件是温度为22℃,NaCl质量浓度为0 mg·mL~(-1),pH值为6.0;菌株vv8的胞外蛋白酶在pH值为5.0～10.0,温度为0～90℃范围内均具有酶活性,其最适酶活温度和pH值分别为40℃,8.5;在最适条件下,蛋白酶具有较高的稳定性,在冻干过程中,添加葡萄糖具有明显的酶活保护作用;Fe~(3+),Fe~(2+),Cu~(2+)等金属离子及乙二胺四乙酸(EDTA)对酶活性有明显的抑制作用,该酶对洗衣液和尿素具有较好的耐受性.