突变型大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因的合成

利用PCR定点突变技术，以野生型大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因为模板，获取3种突变型(Cys85Ser．Cysl51Ser，Cys85／151Ser)二氢叶酸还原酶(DHFR)基因．用限制性内切酶BamH Ⅰ与Pst Ⅰ将3种突变基因片段插入到克隆载体pUC18上，进行蓝白筛选，将筛选的克隆进行DNA序列测定．     

大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达

以大肠杆菌XL1blue为模板，通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因，并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上，构建重组质粒．重组质粒pTrcHisC-TRX在大肠杆菌中高效表达，最后利用固定化金属螫合亲和层析技术(IMAC)获得较纯的目的蛋白，为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件．     

大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物，进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因(NADP-specific glutamate dehydrogenase，gdhA gene)，将所得DNA片断连接到质粒pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选和酶切鉴定，经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和双波长扫描分析，确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在，未能检测到可溶性蛋白的表达，表达量可达菌体总蛋白的15％以上．     

大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基的克隆、表达、纯化及包涵体的复性

利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取酒石酸脱氢酶β亚基基因(TtdB),并将之克隆到质粒pUC18上,转化大肠杆菌DH5α细胞.经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和双波长扫描分析,确定酒石酸脱氢酶β亚基在大肠杆菌中表达时以包涵体形式存在.目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性.复性产率可达90%.     

人肽基脯氨酰顺反异构酶基因的克隆、表达、纯化及热变性交联

蛋白质分子间交联是普遍存在的现象．然而，蛋白质交联的分子机理还不太清楚．为了进一步探测蛋白质交联的分子机理，以及交联能否在异源肽链间发生，本实验室克隆了人肽基脯氨酰顺反异构酶(human Peptidylproly-Cis-trans-isomerase，hPPI)cyclophilin cDNA基因，并纯化出了PPI蛋白．最后，将PPI和．lysozyme蛋白进行热变性交联实验，结果显示在同源和异源肽链间都有二聚体和多聚体形成．并证实蛋白质交联可经三步完成：1)蛋白质构象包括二级结构改变；2)形成分子间二硫键；3)形成分子间异肽键．     

鸡溶菌酶和重组大肠杆菌融合蛋白(NADP-GDH)体外分子交联的初步研究

用PCR方法克隆的大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶 (NADP specificglutamatedehydrogenase ,NADP GDH)基因和其突变基因 ,插入表达载体pTrcHisC构建重组蛋白质表达体系 .经过IPTG诱导表达 ,用Talon固定化金属亲和层析树脂纯化出重组的天然和突变NADP GDH ,将它们和溶菌酶 (Lysozyme)通过热诱导去折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验 ,在去折叠反应液中加入还原剂二硫苏糖醇 (DTT)后 ,不但没有分子间二硫键交联形成 ,同时也没有其他分子间共价键 (异肽键 )交联的形成 .另外 ,半胱氨酸残基定点突变后的NADP GDH重组蛋白质 ,无法参与形成分子间二硫键 ,实验证实经过热诱导去折叠后也没有分子间共价键 (异肽键 )交联 .这些结果进一步证明蛋白质分子间二硫键的形成能够促进蛋白质其他分子间共价键 (异肽键 )的形成 .