糖化酵母在酒精工业中应用的研究 (Ⅱ)——原生质体融合构建能分解淀粉的高温酒精酵母

利用ＰＥＧ诱导原生质体融合技术，进行糖化酵母单倍体２６００７（α，ＳＴＡ，ｉｎｈ，ａｄｅ）和去除了ＩＮＨ１基因的耐高温酒精酵母单倍体菌株Ｚ６－１０（α，ＳＴＡ，ｉｎｈ，ａｒｇ）的同型原生质体融合实验，在再生基本培养基上挑选融合子，获得一株既具有较强糊精利用能力，又耐高温和个产酒精的融合株Ｆ４１。经与亲本酒精酵母二倍体菌株２１００２５玉米发酵性比较，使用Ｆ４１菌发酵可减少４０％的糖化酶用量。     

淀粉直接发酵酒精的菌株选育──内孢霉酵母与酿酒酵母属间原生质体融合

本研究旨在构建直接发酵淀粉生产酒精的酵母菌．选择具α－淀粉酶和葡萄糖淀粉酶活性的Ｅ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａＥ１１灭活的原生质体，与耐高温产酒率高的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨＢ－６－９单倍体进行属间原生质体融合．经３５％ＰＥＧ－５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２诱导，在再生选择培养基上融合率１．０～１．５×１０－６，获得１２个性能稳定的融合株．部分融合株生长速度、淀粉水解能力、可溶性淀粉直接发酵酒精的能力明显高于两亲株．     

酵母酒精耐性机制的研究进展

目前,酵母的酒精耐受机理还未完全清楚。在生长培养基中补充不饱和脂肪酸、维生素和蛋白质可增加酒精耐性。流加培养基的方式、胞内酒精积累、温度和渗透压等因素均与酵母的酒精耐性有关。酒精毒性的复杂性质显示,有很多不同基因可能与酒精耐性机理有关。一些遗传方法(如原生质体融合杂交)和连续培养法已用于酒精耐性酵的筛选,通过对菌株的分离和特性鉴定有助于更好的理解酒精耐性。     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA—28融合基因在酵母中的表达？…

采用酵母杂合启动子ＰＡＤＨＺ－ＣＵＰ１或ＰＡＤＨＺ－ＧＡＰＤＨ及终止子ＴＡＤＨ１,构建了一系列酵母表达载体。在这些表达载体中插入乙肝有面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８后将含乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒ＰＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点。     

啤酒废酵母超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及性质研究

啤酒废酵母（１０８－１０９细胞／ｍｌ）通气发酵后，经乙醇－氯仿沉淀，加热，调ＰＨ，（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀等除去杂蛋白质。最后经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５层析得到纯化的ＣｕＺｎ－ＳＯＤ，酶比活在１５００单位／ｍｇ蛋白以上，酶的分子量为１４８０００，由四个亚基组成，紫外最大吸收峰位于２５６ｕｍ处。Ａ２５６．４／２８０＝１．２２．     

两类微生物SOD的比较研究

报道了酵母ＳＯＤ工程菌ＺＨ－１／ｐＳＨ１比耐高温细菌Ｂ．Ｓ２１１－１５的抗Ｈ２Ｏ２水平高，其单位体积培养液和酵得率约为细菌的二倍，但单位细胞酶的含量比细菌低，高温细菌的ＳＯＤ热稳定性和存放稳定比酵母工程菌好，二者在ｐＨ４－１０范围内都很稳定，但对蛋白的耐受性差异很大，其中酵母ＳＯＤ工程勤务产好。     

树干毕赤酵母固定化细胞的酒精发酵

利用海藻酸铝酸胶包埋，将低浓度的树干毕赤酵母（Pichia stipitis)细胞固定，其凝胶粒直径约2－3mm，经增殖培养，使凝胶珠表面的细胞密集，极大地减少了传递阻力，有利于该酵母细胞的“半好气”酒精发酵，结果表明，固定化细胞戊糖，己糖同步酒精发酵糖液初始PH5．0－5．5较适宜；混合糖60g/L（50％葡萄糖、50％木糖）的固定化细胞酒精发酵，发酵前12h主要利用葡萄糖，12h以后木糖利用占主导地位，以低PH（2．8，2．4，2．0）无菌水处理酵母细胞海藻酸铝凝胶珠，2－3h后又恢复正常PH（5．0）。用PH2．8无菌水处理固定化细胞2－3h，细菌基本上被杀死，而酵母细胞功能不受影响，当PH2．4时，对酵母细胞影响较大，而PH2．0时，酵母细胞严重受损，大部分死亡。     

固定化酵母细胞发酵生产酒精的研究

研究以活性炭为载体的吸附法制备固定化酵母增殖细胞．从糖蜜发酵生成酒精的实验结果表明：对于高浓度底物抑制、产物抑制和温度变化的耐受程度，固定化细胞系统明显优于游离细胞，且其表观动力学常数明显受到扩散影响．在固定化细胞系统的连续发酵过程中，当稀释度为０．８９ｈ－１时，酒精的最大生产能力为１９．５ｇ·ｈ－１·Ｌ－１．     

人Cu,Zn-SOD在酵母系统中的表达

甲醇酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ基因克隆到酵母整合型质粒载体ｐＰＩＣ３．５Ｋ，经转化ｈｉｓ４缺陷型酵母ＧＳ１１５，用ＭＤ培养基及ＰＣＲ方法筛选阳性转化子，并用含Ｇ４１８的ＹＰＤ培养基筛选多拷贝转化子，经甲醇诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的人Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ，经计算机扫描分析，表达量占酵母可溶性     

固定化酵母细胞连续发酵生产酒精的研究

在３００Ｌ容量塔式发酵器中进行固定化酵母细胞连续发酵酒精的小型中放实验，固定化酵母细胞可连续使用３个月以上，在温度３０℃左右，ｐＨ＝４～５及糖浓度１８％（Ｗ／Ｖ）（１１°Ｂｘ）时，每升固定化酵母可产酒精２５～３０ｇ．     

乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达

以酵母载体ＹＦＤ５９为基础,将乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因正向插入组成型启动子ＰＰＧＫ１及终止子ＴＰＧＫ１间,得到表达载体ＹＦＤ５９－ＬＳＳ１。并将该表达载体分别转化ＢＪ２１６８,ＤＢＹ７４６,ＪＲＹ１８８,ＢＪ３５０５ ４株不同的酿酒酵母株。再将ＹＦＤ５９－ＬＳＳＩ质粒上的表达单元克隆至高稳定载体ｐＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点,构建成３个带有不同拷贝数和不同插入方向表达单元的表达载体;ｐＨＣ１     

酵母葡聚糖的制备及理化性质

建立了一种用碱提取面包酵母中葡聚糖的方法,该法制得的酵母葡聚糖是以β－（１－３）－Ｄ－葡聚糖为主链,有约１２％的β－（１－６）分枝的均一性多糖,乙酸能作用β－（１－６）键,使粘度增加;葡聚糖酶能作用β－（１－３）键,使粘度下降。     

酿酒酵母不同嗜杀菌株的比较及相互作用

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株ＳＫ４（Ｋ１型）和ＥＲＲ１（Ｋ２型）为材料，分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性．证明两株菌产生的毒素蛋白的最适条件不同，最适ｐＨ和温度分别为４．８、１６℃和４．２、２２℃，但均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著．ＳＫ４和ＥＲＲ１的嗜杀质粒的比较表明：Ｍ１－ｄｓＲＮＡ质粒和Ｍ２－ｄｓＲＮＡ质粒分子量分别为１．７ｋｂ和１．５ｋｂ，两株菌的Ｌ－ｄｓＲＮＡ质粒均为４．０ｋｂ．用高温和紫外线处理嗜杀酵母，嗜杀活性随之消失．     

新型抗菌肽基因设计、合成及在酵母中的表达(Ⅱ)——抗菌肽 AD 基因在酵母中的表达

将抗菌肽ＡＤ基因定向克隆到大肠杆菌－酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２的ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ位点上,构建成含抗菌肽ＡＤ基因的重组质粒ｐＣＡＤ,转化酵母宿主菌ＡＢ１０３,转化子在缺乏亮氨酸的ＳＤ选择培养中３０℃培养４８ｈ,培养液经简单纯化后,活性蛋白ＰＡＧＥ和琼脂孔穴扩散法测定抑菌活性表明,抗菌肽ＡＤ基因在酵母中获得表达．     

硒酵母生理功能研究（I）：对小鼠全血GSH—Px…

给离乳瑞士种雄性小白鼠饲喂中硒酵母的饲料，测定小鼠全血谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）超氧化物岐化酶（ＳＯＤ）及肝脏过氧化脂质（ＬＰＯ）的含量，结果表明，实验组小鼠全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性及ＳＯＤ活性明显地高于对照组，而小鼠肝脏的ＬＰＯ值显著低于对照组。     

用HPLC法测定红酵母中β-胡萝卜素的含量

对从红酵母中提取β－胡萝卜素的方法进行了初步探讨，并以高压液相色谱（ＨＰＬＣ）方法测定了红酵母中β－胡萝卜素的含量，采用ＯＤＳ为固定相，以甲醇∶氯仿（７０∶３０）为流动相，检测波长为４５０ｎｍ，该方法准确、快速、可靠．平均回收率为９２．０％．     

亚硫酸盐废液戊糖,己糖同步酒精发酵的调控

休哈塔假丝酵母Ｒ（ＣａｎｄｉｄａｓｈｅｈａｔａｅＲ）用于亚硫酸盐制浆废液戊糖、己糖同步酒精发酵时，发酵液ｐＨ值呈规律性变化。引起ｐＨ值变化的原因是发酵过程中酸性非糖还原物被代谢及废液中存在醋酸。废液中已糖对戊糖代谢的抑制可通过调节空气量来解决。还研究了亚硫酸盐制浆废液适宜的发酵条件，在发酵初始ｐＨ５．０～５．５，温度３８±１℃，溶解氧浓度０．９～１．０ｍｇ·Ｌ￣－１的条件下对固形物为１９．９４％的亚硫酸盐制浆废液发酵３４ｈ，废液中戊糖、己糖能同步被酵母利用，糖的利用率为８９．９％，平均每克糖产酒精０．４０ｇ，是理论得率的８３．１％。     

硒酵母生理功能研究(Ⅰ)──对小鼠全血GSH-Px,SOD及LPO值的影响

给离乳瑞士种雄性小白鼠饲喂添加硒酵母的饲料，测定小鼠全血谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）及肝脏过氧化脂质（ＬＰＯ）的含量．结果表明，实验组小鼠全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性及ＳＯＤ活性明显地高于对照组，而小鼠肝脏的ＬＰＯ值显著低于对照组     

捕食线虫真菌自发产生捕食器官的菌株筛选

在Ｃｚａｐｅｋ,ＰＤＡ,ＣＭＡ,ＷＡ四种培养基上,从２１株捕食线虫真菌中筛选到７株在无线虫诱导条件下能自发形成捕食器官的真菌,这些菌株是：Ｊ８－１（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｌｌｉｇｏｓｐｏｒａ ｖａｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）,ＭＷ１７－２（Ａ．ｊａｖａｎｉｃａ）,Ｊ３１－１（Ａ．ｖｅｒｍｉｃｏｌａ）,Ｊ３４－１（Ｄａｃｔｙｌｅｌｌａ ｌｅｐｔｏｓｐｏｒａ）,ＸＺ９－２,ＸＳ２－２,Ｏ１－１（Ａ．     

酵母FD_1菌株的定种研究

通过对分离获得的酵母ＦＤ１的形态、生理、生化、生态等方面的实验与分析，确认该菌株为酿酒酵母（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｒｅｖｉｓｉａｅ）种群的一株应用型酵母。