发酵法生产京尼平菌株的筛选与培养

从土壤中筛选到一株产β-葡萄糖苷酶的菌株FYS-9,其发酵可将京尼平苷转化为京尼平。通过菌落形态特征、孢子和菌丝显微观察及18S rDNA基因序列分析,初步鉴定该菌株为泡盛曲霉（Aspergillus awamori）。以FYS-9为出发菌株,通过紫外线、原生质体诱变,选育得到一株高产β-葡萄糖苷酶的突变株70C-3,该突变株发酵产酶平均酶活力达到36.15IU/mL,比FYS-9提高39.4%。对突变株70C-3发酵转化京尼平苷条件的优化结果表明,在京尼平苷添加量1.5%,30℃、150r/min转化24h的条件下,京尼平苷的转化率达到97.7%,京尼平的产量可达8.5g/L。     

不同β-葡萄糖苷酶性能分析及对罗汉果苷的转化

以Pichia pastoris GS115为宿主,对来源于特异腐质霉Humicolainsolens、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus和黑曲霉Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn进行异源表达。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,分析了3种酶的酶学性质,其中BglAn的酶活力最高,为90.83U/mg。3种酶的最适反应温度和最适pH值范围分别为55~65℃和5.0~6.0。在pH值为6.0、温度50℃、酶量2U的条件下,利用3种酶水解不同浓度的罗汉果苷Ⅴ。结果表明:不同来源的酶水解底物的特异性差别较大,其中BglHi和BglAa水解罗汉果苷Ⅴ生成罗汉果苷ⅢE的转化率较低,仅为5%~7%;而BglAn在底物质量浓度1mg/mL,反应20min时转化率为96.5%;提高底物质量浓度到5mg/mL,反应1h时转化率也可达97.9%,基本实现完全转化。通过酶法转化罗汉果苷Ⅴ,获得了较高纯度的产物罗汉果苷ⅢE,为后期开发不同结构、不同功能罗汉果苷类甜剂提供了新的途径。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶菌株的筛选

采用牛津杯平板透明圈法对研究室保藏的17株黑曲霉菌株进行了β-葡萄糖苷酶产生菌初筛,得到5株透明圈相对明显的菌株,经固态发酵产酶复筛及相关纤维素酶活力的检测,选出一株β-葡萄糖苷酶酶活力高、且纤维素酶活力也较高的菌株niger-2,其β-葡萄糖苷酶酶活力为78.75 U/g、纤维素酶(CMC)活力为312.15 U/g...     

β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及产酶条件优化

利用栀子苷培养基快速筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,其中草酸青霉产酶水平较高.通过单因素实验、均匀设计及回归分析优化了发酵培养基配比和摇瓶产酶最佳条件:麸皮4%,牛肉膏0.2%,NaCl 0.1%,CuSO40.08%,EDTA 0.2%,KH2PO4 0.2%,初始pH 7.0,装液量20 mL/250 mL,温度30℃.发酵液上清中的酶活由最初的16.80 U/mL提高到52.18 U/mL.     

碳源和氮源对黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影响

以黑曲霉(Aspergillus nigernl-1)为产酶菌种,研究了碳源和氮源对β-葡萄糖苷酶合成的影响。结果表明:麸皮为最好的碳源,适宜的使用量为4%;(NH4)2SO4、蛋白胨分别为较佳的无机氮源和有机氮源,由无机氮与有机氮组成的复合氮源更有利于β-葡萄糖苷酶分泌,其适宜比例为0.2%(NH4)2SO4和3.19%蛋白胨。通过碳源、氮源的优化,β-葡萄糖苷酶活力达到4.82 U/mL。     

响应面法优化黑曲霉产β-葡萄糖苷酶培养基的研究

为获得黑曲霉Aspergillus niger M85菌株较高的β-葡萄糖苷酶酶活,本文采用响应面法对该菌株产β-葡萄糖苷酶关键发酵过程参数进行优化。Plackett - Burman试验结果表明,麸皮和MgSO4?7H2O的浓度对产酶结果影响显著。采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,得到麸皮浓度为17 g/L,MgSO4?7H2O浓度为8 g/L,结合中心组合实验及响应面法分析建立了以β-葡萄糖苷酶酶活力为响应值的二次回归方程模型：Y=-19.1057+0.4526X2+ 3.8260X5-0.02775X2X5- 6.3569×10-3X22-0.2085X52 。对方程求极值点得到优化的发酵过程参数：麸皮浓度为18.345 g/L,MgSO4?7H2O浓度为7.963 g/L。在优化后的发酵条件下培养4天,菌株产β-葡萄糖苷酶活力可达0.2640 U/mL,比优化前提高了61.97%。预测模型可靠性高,可应用于β-葡萄糖苷酶发酵条件的优化。产酶进程结果表明：发酵5天后β-葡萄糖苷酶活力可达到最高值0.3334 U/mL,还原糖浓度仅为0.49g/L。     

聚多巴胺辅助磁微球固定β-葡萄糖苷酶的制备与应用

通过溶剂热法和改进的St?ber水解法制备了Fe_3O_4@SiO_2磁性纳米粒子,并用透射电镜对纳米粒子进行了表征.采用聚多巴胺辅助法将β-葡萄糖苷酶固定在磁性纳米粒子上.具体考察了加酶量、多巴胺质量浓度和固定化时间等因素对酶活和酶固定率的影响规律,获得了β-葡萄糖苷酶固定化的最适条件.结果表明,当加酶量为50,U/g、多巴胺质量浓度为1.6,mg/m L、固定化为24,h时,所制备的固定化β-葡萄糖苷酶活力为25.01,U/g,明显优于传统戊二醛交联固定的β-葡萄糖苷酶活力.     

栀子苷的提取及酶促水解生产京尼平的研究

栀子苷是栀子果实中的主要生物活性物质之一.本研究用乙醇浸提栀子果实获得栀子苷浸取液,使用AB-8大孔吸附树脂对栀子苷进行纯化,栀子苷的收率为1.79％.用固定化β-葡萄糖苷酶对纯化后的栀子苷进行酶促水解,获得富含京尼平的栀子苷酶促水解液,经TLC和HPLC分析结果表明:酶法水解12 h后可得到含大量京尼平的水解液.     

南日鲍β-葡萄糖苷酶分离纯化及表征

采用硫酸铵分段盐析、透析、DEAE-纤维素离子交换层析和葡聚糖Sephadex G-100凝胶层析,从南日鲍内脏中分离纯化得到一种β-葡萄糖苷酶.SDS-PAGE分析表明,所纯化的β-葡萄糖苷酶为单聚体,分子量约为90 kDa,N-端8个氨基酸残基序列为AGMLYPRV.β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,最适pH值为5.0,Mn2+、Cu2+、Ba2+和Zn2+对酶活力有显著的促进作用,而Al3+对酶有明显的抑制作用,SDS则使酶变性失活;pNPG与β-葡萄糖苷酶之间的亲和程度最高,纤维二糖和京尼平苷次之,水杨苷最差.     

固定化β-葡萄糖苷酶的酶学性质

以壳聚糖微球为载体构建了固定化β-葡萄糖苷酶,研究了固定化和游离β-葡萄糖苷酶的酶学性质.结果表明:固定化和游离β-葡萄糖苷酶的最适pH均为4.5;固定化β-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃,比游离酶低5℃;固定化β-葡萄糖苷酶的pH稳定性和贮存稳定性明显高于游离酶,但热稳定性略低于游离酶;固定化和游离β-葡萄糖苷酶的表观米氏常数和米氏常数分别为0.52 mmol/L和2.4 mmol/L;固定化β-葡萄糖苷酶重复分批酶解10 g/L的纤维二糖,其操作半衰期为31 d左右.     

苦杏仁苷测定前处理条件的比较优化

为填补苦杏仁中苦杏仁苷测定的前处理条件研究的空白,通过比较不同去皮工艺下对 苦杏仁苷含量的影响,确定了苦杏仁苷测定过程中宜选用的去皮方法。“杀酶保苷”作为前处理过 程的核心工艺,对比不同灭酶工艺对苦杏仁中β-葡萄糖苷酶的灭酶效果,确定苦杏仁苷测定前处 理中宜采用的灭酶工艺,利用响应面试验进一步优化。结果表明：浸泡去皮为苦杏仁苷测定的最 佳去皮方法,苦杏仁苷的损失最低,蒸汽灭酶工艺能够最好地达到“杀酶保苷”的效果。响应面试 验确定了蒸汽灭酶的最佳工艺参数为：蒸汽温度117 ℃,蒸汽时间31 min,蒸汽流量12 m3 /h,可将苦 杏仁中β-葡萄糖苷酶活性降低为0.655×105 U/g,苦杏仁苷含量为5.03%。本研究为苦杏仁的测定 过程安全性评价和苦杏仁苷含量测定提供重要的理论依据。     

芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

库拉索芦荟叶皮经匀浆、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose fast flow层析和Superdex-200prep grade层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,BGL).纯化结果是β-葡萄糖苷酶比活力为98.48U/mg,纯化倍数为328.27倍,酶活性回收率为9.87%,全酶分子质量约为69.3kD,亚基分子质量约为69.7kD.酶学性质研究表明:β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和5.0;在20~30℃及pH4.0~8.0范围内稳定性较好;最适条件下,以pNPG为底物的K_m值为2.21mmol/L,V_(max)为1.381μmol/(min·L).乙醇,抗坏血酸,Mn~(2+),K~+对该酶活性具有激活作用;SDS,Cu~(2+)对该酶活性具有强烈抑制作用;异丙醇,EDTA,尿素,Mg~(2+),Li+对该酶活性影响较小;甲醇对该酶有双重作用.     

β-葡萄糖苷酶高产菌株筛选

以黑曲霉为出发菌株,经紫外线-氯化锂诱变得13株长势良好的单菌落。通过水解水杨苷产还原糖方法测定这13株菌固态发酵产β-葡萄糖苷酶活力,结果表明,IK-7产酶活最高,可达118.95 U/mL,比原始菌株提高了将近6倍。     

产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化

以非解朊栖热菌HG102基因文库筛选的重组质粒pUC18-atgly为模板PCR扩增α-葡萄糖苷酶结构基因,与表达载体pET28α(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.对重组菌的产酶条件进行了初步优化,最终酶活由4.25U/mL提高到40.85U/mL.     

间歇出酶对里氏木霉产纤维素酶的影响

在分批补料的基础上,采用间歇出酶的方法,对里氏木霉产纤维素酶进行了研究。结果表明:分批补料过程中最佳的补料速度为5.5 g/(L·d),在此条件下产酶第8天滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶活力达到14.40 U/mL和1.59 U/mL。在分批补料的基础上进行间歇出酶,与对照相比,第4、6、8天出酶模式(模式1)时,总滤纸酶活力提高18.14%; 第4、7天出酶模式(模式2)时,总滤纸酶活力提高17.75%; 第5、8天出酶模式(模式3)时,总滤纸酶活力提高27.35%。研究表明,通过间歇出酶可以有效提高纤维素酶总滤纸酶的活力。     

纤维素酶液中β-葡萄糖苷酶的分离纯化

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting脱盐柱、Source15Q阴离子交换柱、Source 15 S阳离子交换柱、HiTrap 16/60 Sephacryl S 200 HR凝胶过滤等技术,分离纯化3种来源里氏木霉、黑曲霉、里氏木霉与黑曲霉混合纤维素酶液中的β-葡萄糖苷酶。结果表明,经SDS PAGE电泳鉴定均为电泳纯,测得黑氏木霉、黑曲霉单独培养β-葡萄糖苷酶相对分子质量分别为68、129 ku,而混合菌培养分离得到两种β-葡萄糖苷酶分子质量大小分别为66.2、134 ku。与单独培养的β-葡萄糖苷酶相似。3种来源的β-葡萄糖苷酶经多步分离纯化后的纯化倍数分别为37.25、40.21、30.12,酶活回收率分别为20.1 2%、23.21 %、28.56 %。     

海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的制备及其性质研究

在活性炭、明胶等8种固定化载体筛选的基础上研究了以海藻酸钠为载体,戊二醛为交联剂固定化β-葡萄糖苷酶的条件,并对固定化酶的酶学性质及其在催化制备大豆异黄酮活性苷元染料木素中的应用进行了研究。β-葡萄糖苷酶在0.20%戊二醛溶液中交联2 h后再与20 g/L海藻酸钠混合,然后逐滴加到4 g/LCaCl2溶液中,固化1 h后过滤、洗涤得固定化β-葡萄糖苷酶,固定化酶的酶活回收率为83.67%。固定化酶的最适温度、热稳定性、pH值稳定性以及与底物的亲和力都有所提高,最适pH值基本不变。该固定化酶重复使用6次后其活力仍保持90.94%,染料木苷转化率达60.02%。     

添加外源物对蒸汽爆破玉米秸秆酶水解性能的影响

研究了8种添加物辅助单、双酶水解蒸汽爆破玉米秸秆的效果和规律。结果表明,在8种外源物中,添加Tween-80对β-葡萄糖苷酶和纤维素酶水解的促进作用最佳,可显著提高酶水解得率和酶活的稳定性。在底物纤维素质量浓度为50 g/L、纤维素酶用量为15.0μmol/(min.g)、β-葡萄糖苷酶用量为30.0μmol/(min.g)的条件下,添加4.0 g/L Tween-80反应48 h,纤维素水解生成葡萄糖和总还原糖的酶解得率分别达到86.85%和93.45%,较空白对照分别提高了7.34%和9.59%,其中可发酵性葡萄糖占总还原糖的92.94%。进一步考察该酶解条件下的蛋白质和酶活回收率,结果表明:添加Tween-80后可溶性总蛋白质的回收率提高了56.83%,β-葡萄糖苷酶和纤维素酶酶活回收率分别提高了16.87%和40.04%。     

嗜热侧孢霉2441纤维素酶产酶条件优化及突变株选育

为了提高嗜热侧孢霉2441纤维素酶的产量,对产酶条件进行了优化,测定了酶的特性,对选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株进行了探索.实验中酶活力测定以微晶纤维素、CMC-Na和水杨苷为底物,DNS法测定还原糖;产酶条件优化采用正交试验设计,以微晶纤维素酶活为指标;通过NTG诱变和UV诱变选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株.结果表明:产酶条件优化后,嗜热侧孢霉2441的纤维素酶活极显著提高(P0.01);2441的微晶纤维素酶、CMC-Na酶和β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为60℃、65℃、70℃,最适作用pH值均为5.5,温度高于70℃及碱性条件下,酶活力显著下降;选育的抗葡萄糖效应突变株N20-01,微晶纤维素酶活提高13.203%,CMC-Na酶活提高47.176%,β-葡萄糖苷酶活提高119.517%;选育的中温型突变株U40-03,在32℃培养时与2441在45℃培养时相比,微晶纤维素酶活提高11.411%,CMC-Na酶活提高29.484%,β-葡萄糖苷酶活提高54.759%.     

β-葡萄糖苷酶生物转化刺梨槲皮素糖苷的工艺优化

以不同来源的β-葡萄糖苷酶水解刺梨槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷,探讨提高刺梨黄酮苷元释放能力的生物转化途径。以槲皮素含量与糖苷转化率为指标,采用高效液相色谱法对来源于嗜酸乳杆菌、木霉和杏仁的β-葡萄糖苷酶水解3种槲皮素糖苷的转化率及槲皮素含量进行动态监测,以酶解时间、酶解pH值、酶解温度和酶用量(酶与底物质量比)为单因素,考察各因素参数独立变化对指标的影响,再以Box-Behnken 方法研究各因素及其交互作用对转化率的影响,优化工艺条件。杏仁β-葡萄糖苷酶水解3种糖苷转化所得槲皮素含量最高,对不同底物的转化率由高到低依次为槲皮素-3-O-葡萄糖苷(74.10%)、槲皮素-3-O-芸香糖苷(64.30%)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(31.80%)。杏仁β-葡萄糖苷酶优化水解工艺条件为酶解时间28.90min,酶解pH值4.9,酶解温度52℃,酶用量0.08%。此条件下得到槲皮素-3-O-芸香糖苷转化率71.48%,槲皮素-3-O-鼠李糖苷转化率36.32%,槲皮素-3-O-葡萄糖苷转化率77.86%。