甘蓝型油菜矮化突变体的茎秆发育转录组分析

甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1"是从高秆油菜"3529"理化诱变群体中分离的矮化突变体,它的株高只有高秆亲本的1/3,是一个优良的甘蓝型油菜矮化资源.本文应用RNA-Seq测序技术分析了"NDF-1"茎开始伸长的抽薹期和花期转录组,为深入了解油菜茎秆发育机理提供基因组层面的参考.抽薹期和花期的测序数据通过筛选得到了4.55亿条质量合格的clean reads.经过对高质量序列的组装注释,筛选得到"NDF-1"和"3529"间的2147条差异表达基因(DEGs).选择其中的20个差异表达基因进行了荧光定量PCR验证.通过GO和KEGG分析,发现"NDF-1"的矮化与赤霉素、生长素和油菜素内酯相关,细胞伸长异常和细胞壁的不正常形成也影响"NDF-1"的茎秆发育.从差异基因中筛选出与植物矮化性状相关的基因,为利用矮化基因改善性状和矮化机理的研究和提供了更多信息.     

甘蓝型油菜Tic21基因克隆、表达及拷贝数鉴定

根据拟南芥Tic21基因编码区设计引物,在甘蓝型油菜中扩增并克隆到其cDNA同源基因,命名为BnTic21(GenBank登录号HQ613273),测序结果显示该基因含有5个外显子,4个内含子,cDNA编码区大小为885 bp,编码294个氨基酸,蛋白理论分子量约为31.24kD,等电点11.10.与拟南芥、豌豆等物种氨基酸序列相似性在60.40%～87.75%之间.实时定量PCR对其不同组织特异性表达分析表明:BnTic21在油菜不同部位均有表达,茎尖最高,子叶、真叶、下胚轴次之,根表达量最低.用实时定量PCR检测表明BnTic21在甘蓝型油菜基因组中约有2个拷贝.     

甘蓝型油菜苗光诱导花青素相关BnMYB转录因子的鉴定与分析

为了筛选并鉴定甘蓝型油菜苗光诱导花青素的相关BnMYB转录因子，本文以甘蓝型油菜GLH4为试验材料，通过对光诱导条件下甘蓝型油菜苗的叶片进行转录组分析，筛选出光诱导差异表达转录因子，经染色体定位、系统进化关系和蛋白关联分析等生物信息学分析，鉴定光诱导花青素的相关BnMYB转录因子。结果表明：转录组分析筛选出82个光诱导BnMYB转录因子，其中67个上调表达，15个下调表达；染色体定位发现，82个光诱导BnMYB转录因子分布在17条染色体和2个未知连锁群上；与拟南芥AtMYB蛋白进化分析结果表明，82个光诱导BnMYB转录因子分为17类，其中第Ⅱ类与花青素合成相关；蛋白关联分析结果表明，BnMYB75Ann和BnMYB75C03与花青素合成途径的多个关键酶关联，是甘蓝型油菜苗光诱导花青素合成的调节基因。本研究结果为探究甘蓝型油菜花青素的合成机理奠定基础。     

甘蓝型油菜BnHY5基因的表达模式及非生物胁迫响应分析

为探究甘蓝型油菜中HY5的表达情况,首先通过甘蓝型油菜基因组数据分析预测HY5及其同源基因HYH(HY5-Homologous),克隆获得了四个HY5(命名为BnHY5)以及三个HYH(命名为BnHYH)重复基因全长cDNA序列.其次,对BnHY5进行了蛋白结构预测、理化性质分析,研究结果表明:BnHY5蛋白为不稳定、亲水性蛋白,主要结构域为亮氨酸拉链.最后,探究了甘蓝型油菜中该基因的表达情况,用荧光定量PCR分析了BnHY5重复基因表达模式和响应非生物胁迫的情况,BnHY5四个基因中,BnHY5-2的表达水平最高,BnHY5-1、BnHY5-2不存在组织表达差异且表达水平高于BnHY5-3、BnHY5-4.BnHY5基因不仅响应高温、低温、镉、高盐非生物胁迫,而且参与ABA和GA_3激素信号响应,说明BnHY5在逆境胁迫中有重要作用.此外BnHY5重复基因在非生物胁迫下的表达模式发生改变,BnHY5四个基因的表达占比与不同类型胁迫处理相关,存在表达差异.     

甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.     

甘蓝型油菜异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase)cDNA的克隆与分析

以无花瓣与正常甘蓝型油菜幼嫩花蕾(长度小于0.2 mm)建立的差异表达文库中发现的异胡豆苷合成酶基因（STR）的一个cDNA片段为基础,利用RACE方法获得了甘蓝型油菜的STR基因cDNA全序列BnSTR.序列分析表明BnSTR全长1408 bp,开放阅读框从第20个碱基到第1291个碱基,推导的蛋白序列与Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Oryza sativa, Rauvolfia manni, Catharanthus roseus和Oph     

甘蓝型油菜S-GT基因克隆、hpRNAi载体构建及遗传转化

根据发表的甘蓝型油菜S-GT基因cDNA序列设计引物,以甘蓝型油菜总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长.根据获得的基因序列设计引物扩增出S-GT基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到带有本实验所构建的种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了油菜S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体.通过根瘤农杆菌EHA105介导,转化甘蓝型油菜‘hubu 11'的子叶柄,诱导愈伤组织分化出绿芽,进而再生出完整的植株.通过PCR初步鉴定获得了58株转基因阳性植株.     

转IrrE基因甘蓝型油菜对NaCl胁迫的耐受性应答

以转IrrE基因甘蓝型油菜为材料,研究了转IrrE基因甘蓝型油菜幼苗对NaCl胁迫的耐受性应答情况.在200mmol/L NaCl胁迫下,随着胁迫时间的延长,转IrrE基因和野生型油菜的POD、SOD和CAT三种抗氧化酶活性均增加,其中野生型油菜的三种抗氧化酶在24h后达到峰值,随后逐渐下降,而转IrrE基因油菜的三种...     

甘蓝型油菜BnFAD8基因编码序列的克隆和表达谱分析

通过比对拟南芥等同源基因,克隆了甘蓝型油菜FAD8基因中的保守序列.以得到的FAD8（Fatty Acid Desaturase 8）保守序列片段为信息探针,在GenBank的EST数据库中检索高度同源的EST,并通过人工拼接及RTPCR得到油菜该基因的全长为1299 bp的cDNA序列,命名为BnFAD8.序列分析结果中发现该基因符合质体定位的ω3脂肪酸脱饱和酶序列特征.通过比较22 ℃和8 ℃处理的甘蓝型油菜的BnFAD8基因表达谱,发现该基因在常温下仅存在痕量表达;而在低温条件下在叶中表达出现     

半月国内科技要闻

破译白菜甘蓝油菜全基因组遗传密码由中国科学家领衔的白菜、甘蓝和油菜全基因组测序项目获得了白菜全基因组的精细图,甘蓝和油菜全基因组的框架图。油菜、白菜和甘蓝同属于芸薹属作     

不同作物间共用SSR引物的初步研究

根据相关报道,利用互联网在GENE BANK中查询油菜的简单重复序列及其两端序列来设计引物,并合成了2对甘蓝型油菜的SSR引物（Bn92A,Bn72A),通过所建立的降温PCR（Touchdown PCR)方法,对来自禾本科,十字花科,芸香科,锦葵科等12种经济作物的DNA进行PCR扩增。结果显示,PCR扩增产物条带清晰。所有12份材料用2对SSR引物扩增出的主带片段大小一致,分别为150bp(Bn92A),250bp(Bn72A）。这与文献报道在甘蓝型油菜中SSR扩增出的片段大小完全一致。本研究说明,各物种基因组间存在着相当大的相似性,这2对甘蓝型油菜的SSR引物可在其它经济作物分子标记的基因组比较作图应用。     

牡蛎全基因组测序与功能解析

围绕牡蛎全基因组测序、基因组结构分析、基因注释、重要功能基因发掘和SNP标记开发几个目标展开了研究。采用fosmid克隆混池和等级组装策略成功解决了牡蛎高杂合度带来的基因组拼接困难,得到的基因组Contig和Scaffold N50分别达到19.4 Kb和401 Kb,整体测序深度大于800倍覆盖度。为后续的研究奠定了基础。对牡蛎基因组结构特征进行了分析。其基因组杂合度达到2.3%,重复序列丰富。在全基因组水平筛查到SNP位点312万个,其中基因区的SNP分布少于非基因区。共注释得到基因28 000多个。通过38个发育时期的表达谱测序,筛选到具有不同生物学含义的功能基因集,发掘了大量与生长发育等相关的基因,并对一些基因进行了详细研究。对牡蛎母本效应基因进行了发掘。鉴定出1 307个在雌性性腺中特异高度表达的基因,526个雄性性腺中特异高度表达的基因,包括一些重要的父本效应基因,如K81等。对性别决定基因进行了分析,发现Sox9、SRY等基因在牡蛎雄性性腺中特异表达,可能是决定牡蛎雄性转变的重要调控基因。对重要的发育基因家族进行了详细梳理和进化分析,包括130多种Homeobox基因、20多种Fox基因、10多种Wnt基因等。此外,对一些重要的功能基因如表皮生长因子受体(EGFR)和固醇调节原件结合蛋白(SREBP)等还进行了原味杂交、蛋白重组表达等功能研究。在全基因组范围以及转录区筛选到大量的SNP标记,在一些群体中验证了超过1 500个具有多态性的SNP。并把HSP、类胰岛素多肽等基因的SNP与表型性状进行了关联分析研究,发现一些与生长性状具有显著相关性的SNP标记。由于冠轮动物超门基因组数据缺少,牡蛎基因组的测序为生物多样性和进化生物学研究提供了重要数据。为牡蛎高度适应潮间带环境的分子机制研究提供了重要基础。项目的完成对贝类发育、贝壳形成、海洋无脊椎动物浮游幼虫的进化等机制有了更深入的理解。研究成果丰富了海洋基因资源,开发了大量分子标记,为分子育种的开展提供了条件。     

甘蓝型油菜植物防御素基因的克隆与原核表达

根据Genbank上已知的植物防御素基因设计引物,以甘蓝型油菜中的品种”蜀杂九号”种子总RNA反转录成的eDNA为模板,进行PCR扩增,获得了243bp的片段．将该片段回收。连接到pMD18-T载体测序,将测序片段经酶切回收后克隆到GTK表达载体中,在0．1mmol IPTG诱导下表达出与理论值相符的34kD的融合蛋白条带,用GST单克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,获得阳性结果,这为甘蓝型油菜植物防御素基因功能的进一步研究提供了基础．     

2018年农业科学热点回眸

 盘点了2018年农业科学研发取得的一些重要成果。小麦、水稻、玉米及大豆、荞麦、马铃薯等主要粮食作物在基因组测序、分子育种、遗传机理解析、氮高效利用、起源演化、基因编辑等方面获得快速发展,发布了世界首个六倍体小麦基因组图谱,完成了3000份水稻基因组计划和中黄13的基因组测序,克隆了一系列产量、品质及抗病虫害基因,解析了一些重要的生长发育调控机制。油菜、棉花、茶叶、烟草等主要经济作物在基因组学、风味调控机理、光合效率等方面有所突破,中国油菜基础研究与应用已达到国际领先水平。此外,水稻、小麦、番茄、苹果等作物的病虫害防治,畜禽的繁殖、品种改良和疾病防治,蜜蜂的基因组和转录组解析,蚕病害防治和驯化历史,化肥和水稻品种对气候变化的影响、气候变化对作物产量的影响,茎叶类蔬菜和食用豆收获设备、油菜播种机等农机农艺领域均有突破性进展。     

甘蓝型油菜异胡豆苷合成酶（Strictosidine synthase）cDNA的克隆与分析

以无花瓣与正常甘蓝型油菜幼嫩花蕾(长度小于0.2 mm)建立的差异表达文库中发现的异胡豆苷合成酶基因(STR)的一个cDNA片段为基础,利用RACE方法获得了甘蓝型油菜的STR基因cDNA全序列BnSTR.序列分析表明BnSTR全长1408 bp,开放阅读框从第20个碱基到第1291个碱基,推导的蛋白序列与Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Oryza sativa, Rauvolfia manni, Catharanthus roseus和Ophiorrhiza pumila中STR的同源性分别是91, 41.8, 36.2, 31.2, 29.2和28.4%.表达结果显示,与野生型相比,油菜BnSTR在无花瓣突变型幼嫩花蕾中表达量明显下降, BnSTR可能与花瓣的发育有关.     

Fibrillin转基因油菜的再生及其光合特性的检测

用根癌农杆菌共培养法，以带有1～2 mm子叶柄的完整子叶为转化受体，将连有35S启动子和NPTⅡ标记基因的Fibrillin cDNA导入甘蓝型油菜主要栽培品种“2005南系”中，获得抗卡那霉素的转基因植株.对部分经卡那霉素筛选得到的再生植株进行PCR检测，有来自3个株系的植株表现为阳性，初步证实外源基因已整合到植物细胞基因组中.将转基因植株炼苗后移入大田，在3月初到4月末油菜开花结果期间，对叶片和角果进行光合指标和叶绿素荧光指标的检测以及产量性状分析，发现转基因植株和非转基因植株之间存在明显差异.     

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体pFGC5941-BnBRI1和RNA干扰载体pFGC5941-BnBRI1-Ri,以根癌农杆菌介导的方法转化甘蓝型油菜"W679"下胚轴外植体,经PCR鉴定,获得18株转基因阳性植株,其中1株为BnBRI1基因过量表达转基因植株,17株为BnBRI1基因RNA干扰转基因植株.经RT-PCR鉴定显示,在过表达转基因植株中BnBRI1基因表达量比野生型甘蓝型油菜高,而在RNA干扰转基因植株中表达量比野生型低,RNA干扰BnBRI1基因的表达导致了植株的矮化,矮化植株将可用于油菜株型的遗传改良,以培育适于机械化生产的中矮秆油菜新品种.     

甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri fad2基因片段克隆及hpRNA植物表达载体的构建

首先利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和Lesquerella fendleri基因组DNA中分别扩增出Δ12-脂肪酸去饱和酶fad2基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出相应的小片段,然后将同一基因的大小片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的napin启动子和nos终止子之间,构建成可以在种子中转录表达发夹RNA(Hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体.     

甘蓝型油菜遗传图谱构建及产量相关性状QTL定位研究进展

油菜是世界上重要的油料作物,甘蓝型油菜在油菜生产中占据着主导地位。本文主要综述了甘蓝型油菜遗传连锁图谱构建从最初的RFLP发展到SNP标记及产量性状相关的千粒重、主花序有效角果数和每角粒数等数量性状位点(QTL)定位的研究进展,并指出了目前存在的问题和对甘蓝型油菜图谱构建进行展望,以期为甘蓝型油菜的遗传育种提供理论依据。