小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠand XhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。异丙基β—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3．1载体中;pcDNA3．1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP—c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS—PAGE证实融合蛋白表达成功。说明：成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His／mlrpS融合蛋白。     

肝素酶Ⅰ对合成的肝素五糖的酶解作用及对其抗Xa因子活性的影响

研究肝素酶Ⅰ（来源于Flavobacterum heparinas,EC4.2.2.7)对人工合成的且含有与抗凝血酶Ⅲ特定结合位点的肝素五糖（SHP）的酶解作用,并对酶解作用的动力学进行研究,利用强阴离子高效液相色谱（SAX－HPLC）对酶解混合物进行分离,利用质谱（ESIMS）和核磁共振波谱（1H－NMR）技术对所得的二糖和三糖的结构进行确证。研究 结果表明,这种被作为肝素反向试剂的肝素酶I可水解人工所合成的肝素五糖,从而使之丧失抗Xa因子活性。     

毒性小分子蜂毒肽基因的克隆修饰、融合载体构建及表达研究

通过定点诱变的方法，对小分子蜂毒肽（melitin）基因进行修饰，引入了羟胺裂解位点，使蜂毒肽与其前体蛋白得以在体外融合表达．将融合的蜂毒肽前体蛋白（prcmelittin）经双酶切后克隆到原核表达载体PET-42a（＋）中，PCR鉴定后转化至宿主菌BL21（DE3）中，在异丙祭硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下，在大肠杆菌中实现融合表达．为利用基因下程的方法表达毒性小分子多肽、实现该类药物的产业化打下基础．     

Hirulog 18在大肠杆菌中的表达及其生物学活性检测

以化学合成的Hirulog18基因为模板,经PCR扩增、限制性内切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ消化,将编码Hirulog18的基因片断插入表达载体pET-32b中编码硫氧化还原蛋白（Trx）基因序列的下游.用重组质粒转化感受态大肠杆菌-BL21（DE3）,并用IPTG诱导表达Trx-Hirulog18融合蛋白.复性、肠激酶酶切、Ni-Sepharose和HPLC纯化后,用质谱测定其分子量并进行活性测定.检测结果表明构建的PET-302b/Hirulog18能够在大肠杆菌中高效表达,表达的Hirulog18具有较低的凝血酶抑制活性并能够竞争抑制Angiomax活性.     

肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究

肝素酶 (ＥＣ4 .2 .2 .7)是一类能降解肝素类物质的裂解酶 .自Ｋｏｒｎ等在肝素黄杆菌 (Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｐａｒｉｎｕｍ)中发现了肝素酶以来 ,肝素黄杆菌一直是肝素酶的主要来源 .目前的研究表明 ,肝素黄杆菌中有3种肝素酶 :肝素酶Ｉ[1,2 ] 、肝素酶ＩＩ[3] 和肝素酶ＩＩＩ[4 ] .在它们的共同作用下 ,肝素酶能特异性地断裂肝素链上的特定序列 ,从而产生一系列寡糖片段 .肝素酶具有许多重要的医药用途 ,包括体外循环中肝素的消除[5] ,肝素精确结构的确定[6 ] ,肝素抗凝机理及肝素结构和功能的研究[7,8] ,制备低分子量肝素[9…     

酵母α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

酵母编码α-半乳糖苷酶的基因MEL1被扩增并克隆到表达载体pRSET中,重组质粒pRSET-Gal转化至相应的受体菌BL21（DE3)）PlysS,阳性克隆经液体培养和IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析,在50kD处有一目的分子大小的亮带,裂解细菌后经X-α-Gal的显色底物反应,液体变蓝．试验表明：α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中得到了表达,糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的。     

重组人DNaseⅠ不同表达模式的下游工艺研究

研究了诱导温度对重组人DNaseⅠ(rhDNaseⅠ)在大肠杆菌中可溶表达的影响,发现加诱导剂后在37℃培养时,rhDNaseⅠ融合蛋白以包涵体形式存在;而20℃培养,rhDNaseⅠ融合蛋白有62.3%分泌到周质,并且具有酶活性。对这两种不同表达模式表达的rhDNaseⅠ融合蛋白进行分离纯化,发现前者最终酶活为592.2 U/mg,回收率为32.1%;后者酶活为1283U/mg,回收率为24.1%。比较这两种纯化工艺,分泌表达模式的分离纯化工艺较好。     

低分子肝素治疗不稳定性心绞痛疗效观察

目的探讨低分子肝素在不稳定心绞痛（UA）中的治疗效果。方法通过对本院心血管内科收治的不稳定性心绞痛病人进行回顾性分析。结果低分子肝索组心脏事件的发生明显减少（P〈0.05）。结论在不稳定性心绞痛治疗中加用低分子肝素，可以使患者获得更大的益处。     

木薯醇腈酶(HNL)cDNA在大肠杆菌中高效表达的初步研究

将编码木薯醇腈酶（HNL）cDNA克隆到原核表达载体pBV220，构建了大肠杆菌（Escherichia coli）中表达质粒pBV220-HNL．含重组质粒pBV220-HNL的大肠杆菌D145α菌株经温度诱导后，其表达产物以包涵体形式存在．SDS-PAGE分析及酶活测定的结果表明木薯HNL cDNA在大肠杆菌中成功表达．     

融合型乳酸片球菌素在大肠杆菌中的表达与纯化

为在大肠杆菌中高效表达乳酸片球菌素(PED),按照美国国立生物技术信息中心公布的PED基因序列设计合成引物,以乳酸片球菌基因组DNA为模板,用多聚酶链式反应扩增PED结构基因特异片段,构建编码组氨酸标记硫氧还原蛋白融合PED的重组表达质粒pET32c-PED,并转化大肠杆菌BL21(DE3).在异丙基硫代半乳糖苷诱导后融合蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的28%.经镍亲合层析纯化的融合蛋白用肠激酶裂解,再经超滤纯化,可得78%的收率.融合蛋白没有抗粪肠球菌细菌素活性,被分开的PED恢复了抑菌活性.     

乙酰肝素酶(HPSE)与肿瘤生长、转移关系的研究进展

目的:通过文献学习,了解乙酰肝素酶与肿瘤的生长和转移的关系。结论:1.乙酰肝素酶的表达(heparananse HPSE)通过降解硫酸乙酰肝素细胞(heparansulfate,HS)和降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycan,HSPG),破坏、改变细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基底膜(basement membranes,BM)结构,促进肿瘤细胞侵袭、转移。2.诱导血管的生成直接作用于内皮细胞以生芽方式促进血管生成,通过释放肿瘤微环境和ECM中储存的高活性的HS-bFGF复合物来诱发直接的血管反应,促进肿瘤的生长。乙酰肝素酶的表达是判断多种肿瘤预后的标记物之一。     

乙酰肝素酶(HPSE)与肿瘤生长、转移关系的研究进展

目的:通过文献学习,了解乙酰肝素酶与肿瘤的生长和转移的关系。结论:1.乙酰肝素酶的表达(heparananse HPSE)通过降解硫酸乙酰肝素细胞(heparansulfate,HS)和降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycan,HSPG),破坏、改变细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基底膜(basement membranes,BM)结构,促进肿瘤细胞侵袭、转移。2.诱导血管的生成直接作用于内皮细胞以生芽方式促进血管生成,通过释放肿瘤微环境和ECM中储存的高活性的HS-bFGF复合物来诱发直接的血管反应,促进肿瘤的生长。乙酰肝素酶的表达是判断多种肿瘤预后的标记物之一。     

人工合成人表皮生长因子在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中高产表达人表皮生长因子（hEGF），并探索提高外源基因在pET-3c：BL（DE3）表达系统的表达水平的途径。方法：根据大肠杆菌对密码的偏爱性，合成编码53个氨基酸的hEGF基因，分别以非融合蛋白和融合蛋白两种方式表达。计算机两者mRNA的翻译起始区（translation initiation region，TIR）的结构。结果：融合蛋白表达产量为27％，非融合蛋白的表达用SDS－PAGE检测不到，两者均具有促细胞增殖的活性。融合蛋白mRNA的TIR的△G值较非融合蛋白的高。结论：在pET－3c：BL21（DE3）大肠杆菌表达系统中，以融合蛋白方式表达人表皮生长因子，表达效率高且不影响其活性，此外，mRNA的TIR的结构可能是影响外源基因在本研究的表达系统的表达效率的一个重要因素。     

重组人SOD2／3杂合酶的制备及其生物活性初探

为获得重组SOD2／3杂合酶,以及观察SOD2／3能否转导入宫颈癌细胞,抑制肿瘤细胞的增殖,构建了原核表达载体pET—SOD2／3,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达获得N端带有6个组氨酸标签的sOD2／3杂合酶;用Ni柱金属螯合亲和层析纯化重组SOD2／3;利用肝素柱层析验证SOD2／3的肝素靶向性;将...     

低分子肝素钙、辛伐他汀联合治疗不稳定型心绞痛的临床疗效观察

目的：探讨低分子肝素钙、辛伐他汀联合治疗不稳定型心绞痛的临床疗效．方法：将69例不稳定型心绞痛患者随机分为对照组31例，观察组38例．对照组予硝酸酯类、β-受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、阿司匹林等常规治疗．观察组在上述治疗的基础上给予腹部皮下注射低分子肝素钙0．4ml，每日2次、口服辛伐他汀20mg，睡前服用．以14天为1个疗程进行疗效观察．结果：低分子肝素钙、辛伐他汀组治疗两周后的心绞痛缓解率明显优于对照组（P〈0．05）；24h动态心电图检出的心肌缺血次数、缺血持续时间、缺血最长时间、室性早搏数、阵发性室速次数与治疗前相比两组均减少，但低分子肝素钙、辛伐他汀组明显优于对照组（P〈0．05）；两组问治疗前后试管法凝血时间、部分凝血酶原时间无明显差异，血胆固醉、甘油三酯、低密度脂蛋白、血浆纤维蛋白原舍量在低分子肝素钙、辛伐他汀组治疗后显著减少（P〈0．05）．结论：低分子肝素钙、辛伐他汀对不稳定型心绞痛的临床疗效明显优于常规治疗组．     

小剂量肝素配合低分子右旋糖酐治疗晚期妊娠羊水量过少的效果观察

目的探讨小剂量肝素配合低分子右旋糖酐治疗晚期妊娠羊水量过少的效果的临床效果。方法将入选的晚期妊娠羊水量过少患者66例,随机分为治疗组（33例）,对照组（33例）。对照组予常规处理,治疗组在对照组基础上加用小剂量肝素配合低分子右旋糖酐治疗。结果治疗组治疗后AFI高于对照组,S／D低于对照组（P〈0．05）;治疗组剖宫产率、产后出血率、产后出血量低于对照组,婴儿Apgar评分优于对照组（P〈0．05）。结论小剂量肝素配合低分子右旋糖酐能较好的促进晚期妊娠羊水量的恢复,能降低剖宫产率、减少产后出血的发生,能提高婴儿Argar评分。     

肝素治疗31例弥漫性血管内凝血的分析

目的：观察小剂量肝素或低分子肝素治疗弥漫性血管内凝血(19IC)的疗效．方法：对确诊的31例DIC患者中的大部分患者使用小剂量肝素或低分子肝素．结果：31例DIC患者中20例治愈，治愈率为65．500．使用低分子肝素11例，占所有使用低分子肝素7313％，结论：IDC患者使用肝素或低分子肝素，尤其是使用低分子肝素治疗效果较好。     

人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（hTNFR Ⅰ）基因死亡域在大肠杆菌中？…

将人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（ｈＴＮＦＲＩ）死亡域基因克隆在氯霉素乙酰转移酶的后面，构建成重组表达质粒ｐＬＴ１０ＣＡＴＬＤｄ。该融合蛋白基因转化大肠杆菌后发酵。ＩＰＴＧ诱导２ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定ＣＡＴＬＤｄ蛋白质的分子质量为３９ｋｕ，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验进一步作了鉴定。