辅酶Q_(10)生产菌株粟酒裂殖酵母原生质体制备和再生研究

研究对辅酶Q10生产菌株粟酒裂殖酵母原生质体制备和再生条件进行了优化,确定了原生质体制备及再生的最佳条件为:茵龄20 h,蜗牛酶浓度2 g/L,酶溶液pH值6.5,酶解温度25℃,酶解时间2 h.通过对粟酒裂殖酵母原生质体制备及再生条件的研究,建立了制备粟酒裂殖酵母原生质体的方法,以期进一步通过原生质体诱变获得辅酶Q10高产菌株.     

粟酒裂殖酵母麦芽糖酶基因的克隆及在大肠杆菌内的表达

利用PCR的方法，以粟酒裂殖酵母菌的染色体DNA为模板，扩增得到粟酒裂殖酵母的结构基因，其开放阅读框1740 bp的序列，可以编码579氨基酸，分子量为67.7 kD.利用NCBI对它的蛋白序列进行比对，发现这个蛋白序列与Aspergillus oryza、Candida albicans、Hansenula polymorpha、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pastorianus的麦芽糖酶相比分别具有40.6%、41.6%、37.9%、34.7%、34.5%的相似性.而与粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶具有99.8%的相似性，由此可以得出克隆得到的结构基因应该是粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶结构基因.将克隆的粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶基因克隆到pQE30表达载体中在大肠杆菌中进行诱导表达，然后测定其麦芽糖酶的活力，其酶的比活力是野生菌株的21倍，诱导条件下麦芽糖酶的比活力是非诱导条件下的10倍.     

Ca2+、CaM及CaM拮抗剂对粟酒裂殖酵母质膜H+-ATP酶活性的影响

经差速离心,酸处理,蔗糖密度梯度离心制备粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）质膜H^＋-ATP酶,以研究Ca^2＋、CaM以及CaM拮抗剂对纯化的质膜H＋-ATP酶活性的影响.结果表明Ca^2＋强烈的抑制该酶的活性,而CaM对该酶的活性没有影响,但TFP与Compound R24571这两类CaM拮抗剂又都能强烈地抑制该酶的活性.推测TEP等抑制该酶的活性不是通过与CaM结合作为CaM的拮抗剂竞争性抑制该酶的活性,而是直接对该酶发生作用或者通过磷脂或其它的CaM依赖性的膜蛋白间接对该酶产生作用.     

发酵代谢物对葡萄糖氧化酶生物合成的影响

用膜透析技术和静息细胞系统，对影响葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）发酵的控制因素进行了研究。静息细胞系统显示：鸟氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和胱氨酸等氨基酸对ＧＯＤ的合成有促进作用；葡萄糖酸和丙酮酸对ＧＯＤ的合成有阻遏作用，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ的丙酮酸使酶活降低４６．２４％；２０ｍｍｏｌ／Ｌ的葡萄糖酸使酶活降低２１％左右，但葡萄糖酸浓度增大，有被菌体作为碳源利用的可能。利用膜透析技术可除去部分发酵过程中产生的葡萄糖酸和丙酮酸等阻遏物，减少它们对ＧＯＤ合成的分解代谢物的阻遏作用，与分批发酵相比．提高酶活４０％左右。     

黑果枸杞根际土样来源Salininema属菌株438HGGQ3-1~T的鉴定

采用多相分类学的方法,即通过表型、化学分类和分子分类特征,并综合系统发育分析结果,探究我国新疆库尔勒地区黑果枸杞(Lycium ruthenicum)根际土样来源菌株438HGGQ3-1T的分类学地位.结果显示:菌株438HGGQ3-1T为革兰氏染色阳性,可形成广泛分枝状营养菌丝、略带弯曲的丝状气生菌丝和末端平截的杆状分生孢子,最适生长条件为28～37℃、pH 7.0～7.5和2%～12%(质量分数)NaCl.该菌株的氧化酶活性呈阴性,过氧化氩酶活性呈阳性,以内消旋2,6-二氨基庚二酸作为特征性二氨基酸,以葡萄糖和核糖作为特征性全细胞糖,细胞磷脂包含磷脂酰乙醇胺、二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇甘露糖苷、磷脂酰肌醇和2种含糖的磷脂,主要的甲基萘醌为MK-10(H4)、MK-9(H4)和MK-10(H2),主要脂肪酸为anteiso-C17:0、anteiso-C15:0和iso-C16:0.菌株438HGGQ3-1T与糖霉菌科Salininema proteolyticum Miq-4T、Paraglycomyces xinjiangensis TRM 49201T和Salilacibacter albus J11Y309T同源性较高,对应的16SrRNA基因序列相似度分别为99.79%,99.67%和96.00%,与S.proteolyticumIBRC-M 10908T和P.xinjiangensis CCTCC AA 2013002T的DNA-DNA杂交值均高于70%.综上分析表明菌株438HGGQ3-1T为S.proteolyticum.     

酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、异源表达及重组酶学性质研究

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到蔗糖酶基因(suc2),并将其克隆到表达载体pSE380中,将得到的重组质粒pSE-suc2转化进E.coli BL21中,利用镍金属螯合层析方法分析测定其酶学性质。重组菌株的SDS-PAGE结果显示重组蔗糖酶基因(suc 2)有60kDa目的蛋白出现,纯化的SDS-PAGE分析得到均一的蛋白条带;重组蔗糖酶的Km值为47.73mmol/L,最大反应速率为79.59mg还原糖mg-1蛋白min-1,最适温度为42℃,最适pH值为5.5,Zn2 、Cu2 对重组蔗糖酶酶活有较强的抑制作用,Ba2 、Mg2 、Mn2 对重组蔗糖酶酶活稍有激活作用。     

纤维二糖诱导阻遏真菌合成纤维素酶的特异性基础

定量比较研究黑曲霉 (Aspergillusniger)AMS11和里氏木霉 (Trichodermareesei)QM94 14细胞内、细胞外及细胞质膜结合态 β 葡萄糖苷酶 (βGLase ,EC 3 2 1 2 1)同工酶对 17 5mmol/LD ( ) 纤维二糖 ([α]2 0n 35°) 转化作用 ,旨在揭示多亚细胞定位 βGLase功能差异及物种特异性基础 .结果发现两菌株中胞内和胞外 βGLase都只能水解之产生葡萄糖 ,而质膜结合态βGLase则按一定比例同时将其水解生成葡萄糖和转糖基生成龙胆二糖 ,且菌株AMS11的转化能力都比QM94 14的强 .观察到“葡萄糖亏损”现象 ,暗示该转化过程存在基于葡萄糖耗损的代谢过程偶联 .提出由多亚细胞定位的 βGLase同工酶介导诱导物形成与转化的“亚调控网络”模型 ,解释同一浓度纤维二糖对不同物种具有诱导或阻遏效应差异的生理学基础 .     

谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母菌的初步表达

从重组菌株pPIC3.5k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经Sac I酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与 人血清白蛋白的相互作用

从重组菌株pPIC3.5 k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经SacⅠ酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

High-frequency transformation of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, has been used extensively for genetic studies but until now it has not been utilized as a host organism for DNA cloning. Here we describe a method for high-frequency transformation fo a leu 1(-) strain of this yeast with hybrid plasmids containing the Saccharomyces cerevisiae LEu 2(+) gene, a bacterial plasmid and either the S. cerevisiae 2 μm plasmid or autonomously replicating sequences (ars)(1) derived from S. pombe DNA. Some of the plasmids contain unique restriction sites which make them suitable for the isolation of S. pombe genes, and they can also be used for the exchange of DNA between S. pombe and S. cerevisiae.     

Ca~(2 )对酿酒酵母与粟酒裂殖酵母细胞增殖的影响

SD培养基中外加不同浓度的Ca2 可促进酿酒酵母与粟酒裂殖酵母细胞的增殖 ,但在促进增殖方式上存在明显差异 .随SD培养基中外Ca2 浓度增加 ,酿酒酵母到达稳定期的细胞终浓度也越高 ;而粟酒裂殖酵母生长到达稳定期细胞终浓度随Ca2 浓度增加而增加的效应不明显 .同时SD培养基中外加Ca2 对酿酒酵母的促进作用主要是通过加快生长对数期细胞分裂速度 ;对粟酒裂殖酵母主要是靠缩短生长延滞期来促进增殖 .     

枯草芽孢杆菌高效转化及其转化子验证方法

用构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600感受态细胞,进行不同时间预培养后,涂布于抗生素平板培养,研究一种更高效的转化方法。用载体与外源片段的连接产物转化WB600感受态细胞,进行最佳预培养时间培养后,涂布于抗生素平板培养,培养得到的转化子用PCR快速验证和双酶切鉴定,研究一种转化子的快速验证方法。     

Efficient transformation and expression of gfp gene in the edible mushroom Pleurotus nebrodensis

An efficient transformation method mediated by PEG-protoplasts was developed for the newly commercial edible mushroom Pleu-rotus nebrodensis. Two plasmids were used to co-transform protoplasts of P. nebrodensis. One plasmid is pAN7-1 containing a positive selectable marker gene hph conferring hygromycin B resistance. Another plasmid is pBIue-GFP containing a reporter gene gfp conferring green fluorescent protein. PCR and Southern blot analysis showed that hph gene or/and gfp gene were integrated into the genome of P.nebrodensis transformants. The transformation efficiency of the positive selectable marker gene hph was 3 transformants per microgram of plasmid pAN7-1 DNA, which was about 30 times higher than that previously reported in thoroughly studied Pleurotus species such as Pleurotus ostreatus. The transformation efficiency of the reporter gene gfp was 9 transformants per microgram of plasmid pBlu-GFP DNA. The co-transformation efficiency was 23.68%. This is the first report that a "reporter" gene, green fluorescent protein gene can be successfully stably expressed in this Pleurotus species.     

红色糖多孢菌红霉素抗性基因的克隆与鉴定

将红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）的染色体DNA用PsTi酶切后与载体PUWL201连接，转化变沿青链霉菌（S.lividans)TK23的原生质体。采用双重抗性筛选得到了9个转化子。分别抽提其中的质粒并再次转化原生质体，在含红霉素的平板上各筛选约200个转化子，其中3个在抗性板上生长良好，分别命名为PLP42、PLP1b和PLP44。对其中的PLP42酶切分析表明，其含有约3.0Kb的红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）染色体DNA片段，它的载体部分发生了缺失。以PUC18为载体，将PLP42的1.7kb-KpnI片断克隆、测序、经与Genebank的ermE基因顺序比较，证实巳克隆了Saccharopolyspora erythraea的抗性基因。     

酵母克隆基因的转化和稳定性检测

采用放射性探针分子杂交技术鉴定及选出重组DNA的可靠转化子。实验结果表明:双倍体受体的转化效率约为单倍体的2倍;含有酵母染色体端粒区GT重复顺序的重组质粒的转化效率约为含染色体内部区GT重复顺序重组质粒的3倍;在克隆基因的稳定性方面,整合型转化子要比自主复制型转化子高得多。因此,用酿酒酵母作基因工程生产菌时以双倍体为好。经分析并证实,含酵母染色体端粒区GT重复顺序的重组子有些具有多靶整合作用,这种整合转化在基因工程中有实用价值。     

乙型肝炎表面抗原基因在酵母中的表达——Ⅰ.HBsAg基因在酵母中的克隆

将乙型肝炎表面抗原基因组装进穿梭质粒,经E.coli扩增、鉴定后转入酵母细胞得到了转化子。经放射免疫分析,在此转化子中HBsAg未得到表达,可能是阅读框架不一致造成的。此外,我们对酵母DNA重组技术进行了摸索,并简化和改进了一些步骤。     

粟酒裂殖酵母snR41 snoRNA的鉴定及其结构进化的意义

采用计算机分析和分子生物学实验的方法,在粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中发现和鉴定了一种新的反义snoRNA,命名为snR41,与酿酒酵母Sacharomyces cerevisiae snR41同源分子比较,粟酒裂殖酵母snR41只具有一个指导rRNA核糖甲基化的反义序列,这一发现进一步揭示了反义snoRNA同源分子在一级结构上的多样性,为研究反义SnoRNA结构及进化提供了新的线索。     

Distinct nuclear and spindle pole body population of cyclin-cdc2 in fission yeast.

Cyclins, as subunits of the protein kinase encoded by the cdc2 gene are major controlling elements of the eukaryotic cell cycle. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has a B-type cyclin, which is a nuclear protein encoded by the cdc13 gene. Here we demonstrate the presence of two spatially distinct cdc13 cyclin populations in the nucleus of S. pombe, one of which is associated with the mitotic spindle poles. Both populations colocalize with the product of the cdc2 gene (p34cdc2). Treatment of cells with the antimicrotubule drug thiabendazole prevents cyclin degradation and blocks the tyrosine dephosphorylation and activation of cdc2. These results suggest a key regulatory role of the cdc2-cyclin complex in the initiation of mitotic spindle formation and also that mitotic microtubule function is required for cdc2 activation.     

Efficient transformation and expression of gfp gene in the edible mushroom Pleurotus nebrodensis

An efficient transformation method mediated by PEG-protoplasts was developed for the newly commercial edible mushroom Pleurotus nebrodensis. Two plasmids were used to co-transform protoplasts of P. nebrodensis. One plasmid is pAN7-1 containing a positive selectable marker gene hph conferring hygromycin B resistance. Another plasmid is pBlue-GFP containing a reporter gene gfp conferring green fluorescent protein. PCR and Southern blot analysis showed that hph gene or/and gfp gene were integrated into the genome of P. nebrodensis transformants. The transformation efficiency of the positive selectable marker gene hph was 3 transformants per microgram of plasmid pAN7-1 DNA, which was about 30 times higher than that previously reported in thoroughly studied Pleurotus species such as Pleurotus ostreatus. The transformation efficiency of the reporter gene gfp was 9 transformants per microgram of plasmid pBlu-GFP DNA. The co-transformation efficiency was 23.68%. This is the first report that a ＂reporter＂ gene, green fluorescent protein gene can be successfully stably exoressed in this Pleurotus species.