植物细胞融合的研究进展(综述)

概述了原生质体分离和培养的影响因素，介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。     

植物原生质体培养与遗传操作

一、植物原生质体培养和细胞融合的一些进展 1960年,E.C.Cocking用酶法从高等植物细胞中分离得原生质体,为高效地从高等植物中分离原生质体打开了局面。迄今已能从几乎所有的植物薄壁细胞中分离得生活的原生质体,并对种类日渐增多的植物原生质体进行培养。据不完全统计,迄今世上已能使近百种植物由原生质体培养成植株。在我国,除早年已由胡萝卜、菸草和矮牵牛等原生质体再生植株外,近年对园艺、药用、经济植物和禾谷类植物的十个科约24种植物,用原生质体培养物再生了植     

拟南芥叶肉细胞原生质体分离及影响因素

通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶肉细胞原生质体分离条件的研究,探讨了酶解法制备拟南芥叶肉细胞原生质体的分离条件和影响因素.在不同纤维素酶质量浓度、山梨醇质量浓度、酶解液pH值、酶解时间下,测定了拟南芥叶肉细胞原生质体的产量.结果表明,在20 g/L纤维素酶、140 g/L山梨醇、pH=5.8的酶解液中,酶解时间为1.5 h,原生质体产量最高.同时,在相同分离条件下测定了拟南芥幼叶和老叶的原生质体产量,结果表明,幼叶原生质体产量显著高于老叶.     

活体生物酶分离石花菜原生质体的研究

利用我国生物资源获取廉价酶源，并首次研制成功适用于多种经济红藻原生质体分离的新型混合酶─—活体生物酶混合液。酶解小石花莱Ｇｅｌｉｄｉｕｍｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ３～３．５ｈ可获得大量成活原生质体。原生质体产率为２×１０￣６个／克鲜藻；成活率为５５～６０％；分离细胞原生质浓厚。经培养可迅速分裂，并形成两类细胞团：多细胞团和愈伤组织状细胞团。文中对这两类细胞团的形成过程作了详细描述。并认为它们在现代化海藻生产中，可作为繁殖石花菜营养细胞的来源。新型混合酶的研制成功，为经济红藻的细胞分离与细胞培养开拓了宽阔的道路，对推进我国海藻生物工程的发展将有极其重要的意义。     

玉帘的组织和原生质体培养

玉帘不同外植体培养，诱导出胚性、中间型和非胚性３种类型的愈伤组织，并再生植株，由胚性愈伤组织与叶肉细胞分离出原生质体，进行培养，启动了细胞分裂并形成了多细胞团，同时，还研究了影响玉帘组织培养以及原生质体分离和培养的诸因素。     

新型混合酶分离海萝原生质体的研究

本文报道使用新型混合酶，首次成功分离海萝原生质体的实验结果与培养结果。海萝（Ｇｌｏｉｌｐｅｌｔｉｓｆｕｒｃａｔａ）酶解２．５～３ｈ，获得大量成活原生质体。并观察到原生质体的自融。原生质体产率为３×１０￣６／克鲜藻；成活率为６５％。原生质浓厚的细胞经培养，可形成多细胞团或愈伤组织状细胞团，这与小石花菜细胞的培养结果，基本类同。新型混合酶价格低廉、制作简便；在使用上，还有促进细胞分裂、细胞团较长时间存活的优点。新型混合酶的研制和应用，对促进海藻生物工程的研究和海藻资源的开发，对推进２１世纪海藻高新技术及其产业的发展，将有重大的现实意义和战略性意义。     

酵母原生质体形成中的电镜观察

用蜗牛酶处理对数期啤酒酵母和异常汉逊酵母细胞,可以有效地从中分离到原生质体透射电镜观察证明了细胞中周质体的存在,揭示了酵母原生质体的释放机理和蜗牛酶的作用位点。     

皱叶莴苣_菜心_胡萝卜及其它几种植物原生质体分离方法的初步探索

近年来,原生质体的分离和培养已获得较大的突破,如烟草、胡萝卜、马铃薯、矮牵牛、石刁柏等多种植物已能从原生质体再生成完整的植株,有些作物已从原生质体诱导出愈伤组织,如水稻、玉米等.分离的原生质体,不但能诱导再生成完整植株,还能通过原生质体的融合或摄入外源核酸或细胞器,使具有不同类型遗传特性的原生质体形成杂交细胞,进而打破有性杂交不亲和性的界限,开辟植物遗传育种的新途径.由此可见,原生质体的制备和培养研究是植物体细胞杂交工作中的首要环节.本文对华南栽种的几种作物,初步探索了其原生质体分离的适合方法.     

裙带菜原生质体的分离和培养

本文以裙带菜(Undaria pinnatifida(Harv)Suringat)为材料，进行原生质体分离和培养研究。取得以下结果：1、使用海螺酶(sca snail enzymes)和纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10)，酶解裙带菜细胞壁，在一定的条件下，能够大量地分离成活的裙带菜原生质体。2、实验表明，氯化钠可作为分离裙带菜原生质体研究中的一种理想的渗透剂。3、荧光增白剂染色镜检法可作为鉴定裙带菜原生质体的一种辅助方法，并适用于原生质体再生壁的观察。4，光照(2000-2500Lux)能促使原生质体再生细胞壁，含有蔗糖(W／V，1％)的培养液有助于原生质体再生细胞壁。5、分离的裙带菜原生质体，经培养，已能长成幼体。     

植物原生质体分离和培养中几个问题的探讨

以植物根、茎、叶、叶柄作为原生质体的分离材料，经过分离收集在一定条件下才能培养获得完整的原生质体，原生质体培养基的渗透压应与酶液的渗透压相等．     

杜氏藻与大肠杆菌融合初探

杜氏藻(Dunaliella peircei Nicolai)系真核单胞绿藻,无纤维素细胞壁,细胞膜外由糖蛋白类物质组成柔软的包被,E.coli(Cm~r)内含带Cm~r基因的质粒。以对氯霉素(Cm)抗性的变化作为杜氏藻和大肠杆菌融合的选择标记,因而首先测定了它们在各自琼脂培养基上对Cm(原始浓度125g/1)的抗性水平(Tab.1)。     

Rice protoplasts isolated directly from mature-embryo-derived calli

Mature-embryo-derived calli of japonica rice (Oryza sativa L) Taipei 309 were used for replicated protoplast isolation experiments. Six out of nine callus lines produced protoplasts with satisfactory yield of 5.20×10⁶–8.96×10⁶ protoplasts/g FW (fresh weight). The remaining three callus lines initiated from seeds of cryopreserved-callus-derived plants had rooty calli, resulting in low yield of protoplasts and a large number of isolated banana-shape intact cells. Viability of protoplasts ranged 87.46%–94.15%. The average size of protoplasts was 207.49–379.04 μm² in different callus lines. Comparitive experiments were also carried out using both calli and suspension culture cells for protoplast isolation. The results demonstrated that protoplast isolation of calli was a substantially simplified and reliable method for preparing rice protoplasts. Jin Deming: born in Jan. 1959, Associated Professor     

小麦与高冰草原生质体融合及再生能力的恢复

以普通小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）济南１７７悬浮细胞来源的原生质体与高冰草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｅｌｏｎｇａｔｕｍ）愈伤组织来源的原生质体用ＰＥＧ法诱导融合．由于来源材料的长期继代，小麦原生质体的再生能力已很低；高冰草原生质体不能分裂；而融合产物却能高频率的分化出完整植株．融合再生植株的表型类似高冰草，染色体数目和同工酶谱亦然．但它们早期发育的模式与小麦相似．     

用膜片钳技术测定植物原生质体膜电位

使用膜片钳测量了石防风、烟草及小麦原生质体的膜电位，并与常规膜电位方法做了比较．结果表明，膜片钳法测得的原生质体膜电位为内负外正，低于－５０ｍＶ；常规的插入法测得的为内正外负，大于＋１０ｍＶ．与插入法测得的完整细胞膜电位（低于－１００ｍＶ）相比，膜片钳法测得的原生质体膜电位更为接近．两种方法在原生质体膜电位测量上的差别，可能与原生质体受损的程度不同有关．     

Determination of rare earth elements in plant protoplasts by MAA

A preliminary study on the speciation of rare earth elements in plant cells has been carried out by molecular activation analysis (MAA). Mesophyll protoplasts ofBrassica napus were isolated by enzymatic digestion. After being washed with isosmotic solution containing EDTA for several times, the protoplasts were purified by gradient centrifugation. Then the concentration of rare earth elements (REEs) in the protoplasts was determined by neutron activation analysis. The result shows that REEs can enter the cells of the plant.     

烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究

利用PEG法、高Ca2 高pH法和PEG-高Ca2 高pH法等三种原生质体融合方法,对普通烟草K326和黄花烟草叶肉原生质体进行融合,结果表明,PEG-高Ca2 高pH法的有效融合率最高,融合效果最好.并同时对影响烟草叶肉原生质体融合的其它因素进行了研究和探讨.     

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.     

从水稻悬浮细胞获得原生质体再生植株

以长香稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）（糯稻）的幼嫩种子限为材料，在ＭＳ和Ｎ６基本培养基上诱导产生结构松散的愈伤组织，在ＡＡ培养基中进行液体振荡培养，悬浮细胞经酶解后获得了少在性较好的原生质体，试验证明，水稻悬浮细胞是分离原生质体较理想的材料，在附加２．４－Ｄｌｍｇ／Ｌ（以下单位同），ＫＴ０．２，谷氨酰胺８６７，天门冬胺酸２６６的ＭＳ琼脂糖培养基中，诱导出了大量愈伤组织；在含ＫＴ２，ＮＡＡ０．     

黄瓜子叶原生质体的培养与分化

从黄瓜无菌苗子叶游离原生质体,培养在含NAA1mgL~(-1)+2,4-D0.5mgL~(-1)+6-BA0.5mgL~(-1)的MS(大量元素减半)和DPD液体培养基中,3d后开始第1次分裂。10d后形成细胞团,在2种培养基中均形成愈伤组织,转入含IAA3mgL~(-1)+6-AB1mgL~(-1)的MS固体培养基后分化出苗。实验对黄瓜无菌苗子叶游离原生质体的光照和温度条件进行了研究,从1500Lux至25000Lux的光照强度对原生质体的游离没有明显的影响昼夜温差是一个重要的影响因子,恒温下生长的无菌苗,原生质体游离较困难同时讨论了子叶及叶片的细胞形态与原生质体游离的关系。     

单倍体小麦与簇毛麦的不对称体细胞杂交

以小麦杂２４２（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ,ｃｖ．２４２）花药来源的愈伤组织分离原生质体作受体;簇毛麦（Ｈａｙｎａｌｄｉａｖｉｌｏｓａ）幼胚来源的愈伤组织原生质体经２２０μＷ／ｃｍ２紫外线照射３０ｓ作供体,用ＰＥＧ法诱导融合,最后获得再生愈伤组织．对融合再生的４个最先长大的细胞系进行染色体,同工酶和ＲＡＰＤ分析．结果表明,这些细胞系均为体细胞杂种,ＲＡＰＤ技术可作为小麦体细胞杂种早期鉴定的有效方法