糖化酵母在酒精工业中应用的研究 (Ⅱ)——原生质体融合构建能分解淀粉的高温酒精酵母

利用ＰＥＧ诱导原生质体融合技术，进行糖化酵母单倍体２６００７（α，ＳＴＡ，ｉｎｈ，ａｄｅ）和去除了ＩＮＨ１基因的耐高温酒精酵母单倍体菌株Ｚ６－１０（α，ＳＴＡ，ｉｎｈ，ａｒｇ）的同型原生质体融合实验，在再生基本培养基上挑选融合子，获得一株既具有较强糊精利用能力，又耐高温和个产酒精的融合株Ｆ４１。经与亲本酒精酵母二倍体菌株２１００２５玉米发酵性比较，使用Ｆ４１菌发酵可减少４０％的糖化酶用量。     

利用原生质体融合提高酿酒酵母赖氨酸含量的研究

以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)为出发菌株，经N-甲基-N‘-亚硝基胍（NTG）和紫外线（UV）诱变，选育出抗S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC）和抗氯化理（LiCl)的抗药性菌株作为融合新株的细胞质基因标记。用100mg/ml蜗牛酶制备亲株的原生质体，两亲株的原生质体在35%PEG（MW6000），0.01mol/L CaCl2条件下被诱导融合，融合频率为10^-6 - 10^-7。试验表明，这些融合菌株具有杂种性质。其中一株产胞外赖氨酸的能力比亲株明显增强。     

种间原生质作融合构建耐热性α—淀粉酶高产菌株的研究

以枯草芽胞杆菌BF7658和高温芽胞杆菌SW2—3为亲株,通过原生质体融合,获得一株稳定的融合子BSF_1.该融合子生长温度为中温型,与BF7658相同;而融合子酶的热稳定性与SW2—3相似,摇瓶酶活性为160μ/mL.     

十种热带雨林植物光活化抗微生物活性的筛选

为从植物中寻找具有光调节生物活性的物质,通过滤纸片法和薄层色谱自显影技术,以金黄色葡菌球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、草分枝杆菌（Mycobacteium phlei）、环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）为供试菌,对10种热带雨林植物进行光活化抗微生物活性的筛选和活性部位的确定.结果表明：0.1mg的狗花椒（Y10）氯仿提取物对枯草芽胞杆菌具有明显的光活化抗微生物活性,在紫外光照射后和黑暗中抑菌圈相差4mm,薄层色谱中0.5mg Y10氯仿提取物抗枯草芽胞杆菌的抑菌圈最大.本研究为进一步从该植物中寻找新型光敏剂奠定了基础.     

褐球固氮菌和荧光假单胞菌原生质体制备条件的研究

为了利用原生质体融合技术获得同时具备固氮、解磷、抑病等活性的多功能菌株,本文对褐球固氮菌A41和荧光假单胞菌P32原生质体的制备条件进行了研究。通过对菌龄、酶解温度、酶浓度、酶解时间等影响因素的正交实验确定了褐球固氮菌A41和假单胞菌P32原生质体制备的最佳条件。实验结果表明,固氮菌A41最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度3mg/mL、酶解时间45min;假单胞菌P32最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度2mg/mL、酶解时间30min。     

酵母嗜杀质粒融合转移──Ⅰ．融合转移系统的建立

以嗜杀酵母ＥＲＲ１和啤酒生产酵母ＡＳ２４２０出发菌株，建立了供体菌ＭＫ２－３：Ｋ＋Ｒ＋Ｌｅｕ－ρ＋（ｎ）和受体菌ＡＳ２４２０－１：Ｋ－Ｒ－ｌｅｕ＋ρ°（２ｎ）．对原生质体制备再生条件的研究结果表明两株菌的原生质体制备条件不尽相同；同一菌株原生质体形成与再生的最佳条件也不相同．有利于融合再生的原生质体制备条件是ＭＫ２－３：菌龄３０ｈ，蜗牛酶解量３０ｇ／Ｌ酶解时间３０ｍｉｎ，此时原生质体形成率为８０％，而再生率达１７．１％，这些条件对嗜杀活性无影响，再生菌落的嗜杀活性率达１００％；而ＡＳ２４２０－１；菌龄２４ｈ，蜗牛酶量２０ｇ／Ｌ，酶解时间３０ｍｉｎ，原生质体形成率为８１％，再生率为１８．１％．对四种渗透压稳定剂的再生效果实验表明甘露醇效果最佳，氯化钾次之，考虑到廉价，氯化钾是很好的代用品，在３０％ＰＥＧ６０００及Ｃａ２＋条件下进行原生质体融合，融合率可达８．９×１０－６，对其中的融合子ＭＡＲ４的遗传性状及嗜杀活性的稳定性检测，ＤＮＡ含量及细胞大小测定，ｄｓＲＮＡ质粒的提取及电泳结果分析和发酵性能测定，结果表明融合子ＭＡＲ４具有较高的嗜杀活性并可以稳定遗传，有与供体菌ＭＫ２－３嗜杀质粒ｄｓＲＮＡ相同的电泳行为，     

应用正交实验研究铜绿假单胞菌原生质体制备与再生

通过对铜绿假单胞菌原生质体制备与再生进行正交实验,探讨各因子对铜绿假单胞菌原生质体制备与再生影响水平,得到铜绿假单胞菌原生质体制备与再生的最优条件:酶解时间 0. 5h,酶浓度 2mg/L,菌龄为 15h 此时原生质体形成率为 80. 5%,再生率为 20. 6%     

淀粉直接发酵酒精的菌株选育──内孢霉酵母与酿酒酵母属间原生质体融合

本研究旨在构建直接发酵淀粉生产酒精的酵母菌．选择具α－淀粉酶和葡萄糖淀粉酶活性的Ｅ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａＥ１１灭活的原生质体，与耐高温产酒率高的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨＢ－６－９单倍体进行属间原生质体融合．经３５％ＰＥＧ－５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２诱导，在再生选择培养基上融合率１．０～１．５×１０－６，获得１２个性能稳定的融合株．部分融合株生长速度、淀粉水解能力、可溶性淀粉直接发酵酒精的能力明显高于两亲株．     

马铃薯叶肉细胞感染Phytophthorainfestans（Mont.）dby的变化

Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ游动孢子在０．４ｍｏｌ／Ｌ甘露醇溶液的Ｒｏｓｓ原生质体培养基中生长表明。在最初几小时生长的差别不大，只有经过２０ｈ之后，在培养基中游动孢了孢芽长度比对照（水中）较长。在液体培养基中共同培养原生质体和孢芽，没有发现游动孢子孢芽营养趋向。同时，Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ不同生理小种菌丝体潜育的原生质体的存活率，经过５－６ｈ有显著差别。贝拉（Ｂｅｅｌｌａ）（Ｒ１）品种原生质体在生理小种     

应用原生质体融合技术选育L-异亮氨酸生产菌

以黄色短杆菌WY10和ASL495为亲本菌株，分别摸索了其原生质体形成和再生的条件，并在此基础上，进行了原生质体融合试验，考察了PEG浓度、融合时间等条件对原生质体融合的影响；最后利用所确定的条件对两亲株进行了融合，筛选出目的融合子WYA09和WYA17，带有双亲株标记Met^-和Leu^-。经产酸验证后，产酸量没有大幅提高，但副产氨基酸(主要是亮氨酸)减少，对工业生产中分离提纯工作和下一步的筛选高产菌工作都大有益处。     

灭活酵母细胞原生质体融合技术的研究

报道了将单一亲株灭活的原生质体融合方法.融合体细胞形态大小、同化和发酵淀粉的能力均与双亲株不同,多数融合体的DNA含量是二亲株之和,推测为三倍体.融合体的细胞生物量比亲株高,发酵酒精能力增强,具有一定的生产应用价值.     

Microbial starch-binding domains are superior to granule-bound starch synthase I for anchoring luciferase to potato starch granules

Microbial starch-binding domains (SBD) and granule-bound starch synthase I (GBSSI) are proteins which are accumulated in potato starch granules. The efficiency of SBD and GBSSI for targeting active luciferase reporter proteins to granules during starch biosynthesis was compared. GBSSI or SBD sequences were fused to the N- or C-terminus of the luciferase (LUC) gene, via an artificial Pro-Thr encoding linker sequence. The genes were introduced into an amylose-free (amf) potato mutant. It appeared that SBD was superior to GBSSI as a targeting sequence, mainly because the luciferase retained higher activity in the SBD-containing fusion proteins than in the GBSSI-containing ones.     

酵母细胞原生质体拆合技术的研究 Ⅰ.K氏酵母原生质体再生和拆分的研究

微生物细胞原生质体拆合技术是在细胞融合基础上发展起来的一项新兴技术。本课题选择高产酒精的K氏酵母和具有淀粉糖化能力的黑曲霉进行拆合研究,以期形成核体/胞质体一原生质体,核体/胞质体—核体/胞质体等多种类型的融合子,实现远缘杂交。本文深入研究多种因素对K氏酵母原生质体制备的影响,并添加了牛血清白蛋白,聚乙烯吡咯烷酮;酵母细胞壁合成前体物以提高原生质体再生能力,当原生质体形成率>95%时,再生率最高达58.6%。此外,本文初步研究了酵母原生质体的分部拆分。     

磷酸型两性淀粉糊化性质的研究

运用Brabender粘度计对磷酸型两性淀粉的粘度曲线进行了测定，研究考察了不同阴、阳离子取代度不同pH值对磷酸型两性淀粉糊化性质的影响，并同原淀粉及阳离子淀粉的糊化性质作了比较。结果表明：磷酸型两性淀粉经阳离子淀粉具有较高的热稳定性和冷粘稳定性；阳离子取代度及阴阳离子比对磷酸型两性淀粉的糊化性质有很大的影响；磷酸型两性淀粉还具有一定的抗酸降解能力，在pH值为9．0的稀碱溶液中，碱对磷酸型两性淀粉的糊化没有明显的促进作用。     

莱茵衣藻腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的相互作用蛋白组分析

微藻利用光能和CO₂合成淀粉作为藻细胞的储能物质,是以燃料乙醇为代表的液体生物燃料的可持续原料来源.理解微藻淀粉代谢关键酶的催化机制和调控方式是基因工程操作以提高藻细胞淀粉积累能力的前提. 基于此,以莱茵衣藻淀粉合成代谢中的关键酶腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化亚基为探针蛋白,获取该酶的GST融合蛋白后使用GST沉降分析实验结合HPLC-MS/MS的蛋白质检测技术及生物信息学分析方法获得一组与AGPase催化亚基存在相互作用蛋白质,主要包含分子伴侣蛋白、光合作用相关蛋白和信号蛋白分子等. 通过综合分析上述蛋白组的生理功能及亚细胞定位,揭示了它们通过与AGPase相互作用在淀粉合成代谢中的生物学意义.      

重组草酸青霉生淀粉糖化酶的酶学特性鉴定

【目的】了解在毕赤酵母中表达的来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)GXU20的重组生淀粉糖化酶的酶学特性。【方法】用3,5-二硝基水杨酸法测定pH值、温度、金属离子和化学试剂对纯化的重组生淀粉糖化酶的活力的影响,同时测定酶的底物特异性、酶对生淀粉的吸附能力以及酶对不同生淀粉的水解效率等,用高效液相色谱法对该酶水解生木薯淀粉的产物进行分析鉴定,用扫描电子显微镜观察重组酶对不同生淀粉颗粒的水解方式。【结果】重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的最适pH值为4.5,最适温度为65℃,在pH值为2.0~10.0时,重组酶具有较好的pH耐受性,温度小于50℃时,酶的稳定性好。除Ag~+、Cu~(2+)和SDS之外,其他大部分金属离子和化学试剂对重组酶的酶活力影响不大。重组生淀粉糖化酶对大米和玉米生淀粉的活性较高,对木薯和马铃薯生淀粉的活性次之,重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同生淀粉的吸附能力与其对相应不同生淀粉的水解活性大小呈正相关。扫描电子显微镜观察表明重组生淀粉糖化酶对不同生淀粉颗粒的降解作用明显,水解方式各有特点。高效液相色谱分析表明该重组生淀粉糖化酶水解生木薯淀粉的产物仅有葡萄糖。重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在40℃下对大米和玉米生淀粉水解72h后水解率分别达到86.5%和71.9%。【结论】重组生淀粉糖化酶具有广泛的pH耐受性,对生淀粉具有高水解活性,在生淀粉的水解和生料同步糖化发酵生产酒精中有一定的应用潜力。     

淀粉—DMDAAC接枝共聚的研究

采用硫酸高铈为引发剂,合成了淀粉接枝DMDAAC(二甲基二烯丙基氯化铵)共聚物。在讨论引发剂浓度、PH值、反应温度对接枝共聚影响的前阶段工作基础上[1],研究淀粉与DMDAAC比、反应物浓度对接枝率和接枝效率的影响,对接枝共聚物进行红外表征,并评价了接枝共聚物的粘土防膨性。     

羟基增塑剂的羟基数目对淀粉浆料增塑作用的影响

以淀粉浆膜的断裂伸长为评价标准,通过对比试验评价羟基增塑剂对淀粉浆料的增塑作用,从分子结构上认识羟基增塑剂的羟基数目对淀粉浆料增塑作用的影响,并通过浆液特性及黏附性能评估羟基增塑剂正戊醇、正丁醇、1,2-丙二醇、乙二醇、甘油、1,1,1-三羟甲基丙烷、季戊四醇、木糖醇及山梨醇的使用效果.研究结果表明:羟基增塑剂对淀粉浆料都具有增塑作用,能够改善淀粉浆膜脆而硬的缺陷.随着增塑剂羟基数目的增加,淀粉浆膜的断裂伸长率逐渐增大;在羟基数目为3时,增塑作用达到最大;但进一步增加羟基数目,增塑作用下降.在所研究的羟基增塑剂中,甘油和1,1,1-三羟甲基丙烷的增塑作用效果最明显,以其作为淀粉浆料的增塑剂,可以减少浆纱和织造落物,提高织造效果.     

扁玉螺植物消化特性的初步研究

对扁玉螺各消化器官消化酶活力测定表明，扁玉螺有一定的消化植物的能力，其中淀粉水解能力相对较高和较稳定，纤维素水解能力低，没有褐藻酸水解能力，海藻多糖水解水解能力不稳定，蛋白质和脂肪水解能力处于相对较低的水平，比较各消化器官重量和蛋白含量，表现唾液腺的肝脏的作用接近，胃，小肠和直肠作用接近，可能唾液腺和肝脏是消化酶的主要产生部位。     

基于遗传粒子群的图像融合算法及应用

为改善传统图像融合方法对细节信息的丢失,提出了一种基于遗传粒子群算法（geneticalgorithmofparticleswarmoptimization,GAPSO）的图像融合方法,该算法应用于像素级的图像融合,使图像融合问题归结为最优化问题．该算法结合遗传算法和粒子群算法的优点,对标准粒子群算法进行了改进,将交叉与变异算子引入到标准粒子群算法,提高了该算法的收敛性能和全局求解能力．实验结果表明,该算法获得的评价指标都优于遗传算法和PSO算法,且融合图像较好地从源图像中提取了有用信息,提高了融合质量．