紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究：Ⅲ.诱变…

以地衣芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＬｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）５３号菌为出５３－Ｇ３８－６，产酶活的最佳条件下制备原生质体，并对原生质体进行了多次诱变处理，从大量突变株进行筛选最终获得了高产、稳定、耐热的碱性蛋白酶产生菌５３－Ｇ３８－Ｋ６，产酶活力由１１０４Ｕ／ｍｌ提高到２２０８０Ｕ／ｍｌ。     

真核原核两界细胞融合子SEM形态

报道应用扫描电子显微镜（SEM）、测定跨界融合Fhhh细胞形态的结果。Fhhh由2株真菌真核细胞与1株细菌原核细胞的原生质体融合而成。2株真菌是黄孢原毛平革菌和酿酒酵母，1株细菌是从对苯二甲酸废水活性污泥中筛选获得的土细菌。3个亲株菌体细胞SEM的形态差异极为显，既不同于黄孢原毛平革菌与土细胞的首次跨界融合获得的Fhh，也不同于Fhh与酿酒酵母的2次跨界融合获得的Fhhh。经过350多代的繁殖传代。Fhhh仍然同时含有来自3亲株的基因DNA，具有分子遗传稳定性。研究结果表明，跨界原生质体融合是一种快速有效的构建基因工程菌的生物技术。     

一株高温菌的原生质体的再生条件

近年来微生物的原生质体融合技术在微生物遗传育种中越来越显示出广阔的前景.微生物的原生质体制备和再生是微生物原生质体融合的基础,这方面的工作在国内外已有不少报导,但都是偏重于常温菌方面的工作.高温菌原生质体的制备特别是再生条件的探索尚未见报导.本文报导提高一株高温菌原生质体再生率和增大再生菌菌落的条件.     

大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的原生质体融合

本文对大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）的原生质体融合进行了研究，获得了融合菌原生质体的再生，根据两种菌的形态和利用淀粉的能力上存在的明显差异，对融合菌的原生质体进行筛选，实验结果表明，融合细胞具有降解淀粉的能力，但不形成芽胞。     

产α-ALDC的枯草芽孢杆菌原生质体融合条件

通过双亲灭活原生质体融合技术对2株产α-乙酰乳酸脱羧酶的枯草芽孢杆菌3226-5和V-20进行原生质体融合.初步探讨了2菌株较适宜的融()条件.对获得的几百株融合子进行酶活比较,从中得到20株酶活比双亲高的菌株.     

用激光辐照棒状杆菌原生质体选育谷氨酸高产菌的研究

以钝齿棒杆菌T6-13为出发菌,采用甘氨酶-青霉素G-溶菌酶处理其细胞,酸处理10小时制备的原生质体用激光辐照5分钟,挑取再生后菌落进行筛选,选育出二株高产菌5-20和5-21,最高产酸率分别为9.79％和9.65％,最高转化率分别为69.95％和68.96％,比出发菌提高44.83％和42.70％;5-20菌株在3万升大罐中试生产9罐,平均产酸6.79％,平均转化率为52.06％.     

米曲霉与黑曲霉原生质体种间电融合杂交育种

研究了培养基、菌龄、缓冲系统、渗稳剂、酶系统等因素对米曲霉和黑曲霉原生质体制备和再生的影响，探讨了电融合的最佳条件。通过种间原生质体电融合，得到了稳定的重组子。测定了融合子的生长速度、蛋白酶活性和酯酶同工酶酶谱，与亲本进行比较，得到两株生长较快、蛋白质酶活性较高的融合菌株，拮抗实验表明，他们是不同于亲本菌的新菌种。     

糖化酵母在酒精工业中应用的研究 (Ⅱ)——原生质体融合构建能分解淀粉的高温酒精酵母

利用ＰＥＧ诱导原生质体融合技术，进行糖化酵母单倍体２６００７（α，ＳＴＡ，ｉｎｈ，ａｄｅ）和去除了ＩＮＨ１基因的耐高温酒精酵母单倍体菌株Ｚ６－１０（α，ＳＴＡ，ｉｎｈ，ａｒｇ）的同型原生质体融合实验，在再生基本培养基上挑选融合子，获得一株既具有较强糊精利用能力，又耐高温和个产酒精的融合株Ｆ４１。经与亲本酒精酵母二倍体菌株２１００２５玉米发酵性比较，使用Ｆ４１菌发酵可减少４０％的糖化酶用量。     

应用原生质体融合技术选育克拉维酸高产菌株

采用棒状链霉菌种内原生质体融合技术,选育克拉维酸高产菌株.该实验选用舒巴坦钠耐受性高产菌株Streptomyces clavuligerus B71-3-10和甘油耐受性高产菌株Streptomyces clavuligerus B71-14为亲株,优化了原生质体制备条件和融合条件,最终得到遗传稳定性良好的融合子F14.该融合子的克拉维酸产量提高到650.35 mg/L,分别比亲株S.clavuligerus B71-3-10和S.clavuligerus B17-14的克拉维酸产量高36.77%和20.84%.将原生质体融合技术应用到棒状链霉菌克拉维酸高产菌株的选育中,证明了其可行性、高效性及成效显著性.     

2-酮基-L-古龙酸高产菌株的选育

实验采用离子注入技术对"二步发酵法"生产维生素C中的伴生菌-苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)进行处理,筛选维生素C的前体2 酮基 L 古龙酸的高产伴生菌菌株,以提高发酵生产水平。经过初筛、复筛,获得了使产酸活性提高的突变株,在筛选的646株菌中,有3株菌使收率提高了1-4%。     

用原生质体融合法优化啤酒酵母的凝絮性和发酵性能

以发酵度较高、凝絮性较差的啤酒酵母菌株H38的原生质体为受体,以凝絮性较强、发酵度较低的啤酒酵母菌株N1热灭活的原生质体为供体进行融合.用正交试验法分别优化两亲株的原生质体制备和再生的条件以及原生质体融合的条件.用制霉菌素抗性为遗传标记选择融合子.融合子初筛时以凝絮性为指标,复筛时以发酵度和发酵液中的主要风味物质的含量为指标.对得到的融合子进行了异核体和遗传稳定性的检验,结果得到两株凝絮性以及发酵特性较好的菌株HN31和HN40.     

产辅酶Q10的类球红细菌原生质体制备和再生研究

 辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)是人类细胞自身产生的内源性辅酶因子,是一类天然抗氧化剂,目前已广泛应用于医药、食品、化妆品等诸多领域.基因组改组技术的核心内容为原生质体融合,为了提高基因组改组的效率,提高辅酶Q₁₀的产量,本研究对产辅酶Q₁₀的类球红细菌原生质体制备及再生条件进行了优化,通过生长曲线、正交试验等确定了原生质体制备及再生的适宜条件：溶菌酶浓度1mg/mL、作用温度37℃、作用时间1h以及再生培养基蔗糖浓度10%.在此条件下,类球红细菌原生质体形成率可达到96.1%,再生率可达到28.8%.这为进一步对该菌的基因组改组研究奠定了基础.     

Enhancement and selective production of avermectin B by recombinants of Streptomyces avermitilis via intraspecific protoplast fusion

Among eight components of avermectin, B1 fractions have the most effective antiparasitic activities and the lowest level of toxic side-effects and are used widely in veterinary and agricultural fields. In-traspecific protoplast fusion between two strains of Streptomyces avermitilis, one an avermectin high producer (strain 76-05) and the other a genetically engineered strain containing the mutations aveDˉ and olmAˉ (strain 73-12) was performed for enhancement and selective production of avermectin B in the absence of oligomycin. Two recombinant strains (F23 and F29) were isolated and characterized with regards to the parental merits. F23 and F29 produced only the four avermectin B components with high yield and produced no oligomycin. The avermectin production of F23 and F29 was about 84.20% and 103.45% of the parental strain 76-05, respectively, and increased about 2.66-fold and 3.50-fold, re-spectively, compared to that of parental strain 73-12. F23 and F29 were genetically stable prototrophic recombinants and F29 was quite tolerant of fermentation conditions compared to avermectin high producer parental strain 76-05. The ability to produce avermectin B with high yield without the produc-tion of other avermectin components and oligomycin will make F23 and F29 useful strains for aver-mectin production. Strain F29's tolerance of fermentation conditions will also make it suitable for in-dustrial applications.     

双亲灭活原生质体融合技术在苏云金杆菌菌种选育上的应用(Ⅱ)——融合产物的鉴定

在双亲灭活原生质体融合选育苏云金杆菌新菌株的过程中,最终筛选出一株毒力效价较双亲分别提高４１％和１１７％的新菌株３＃。该菌株的酯酶同工酶谱及晶体蛋白多肽均与双亲有显著不同。     

抗药标记酿酒酵母菌株间原生质体融合的研究

酵母属中的一些种是生产单细胞蛋白的主要菌株,通过遗传工程选育高赖氨酸酵母有重要的理论意义和价值,采用100mg/ml蜗牛酶制备亲株的原生质体,在35%聚乙二醇(MW6000)的作用下,成功地获得了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的株间融合重组子,融合频率为10~(-8)-10~(-7),经过五代的移接验证,融合子稳定,融合子抗药性产生叠加效应,个体形态发生了变化,DNA含量加倍,赖氨酸含量有所提高.     

高山被孢霉高产ARA的原生质体融合子筛选

利用原生质体融合技术,对两株单一优良性状差异显著的高山被孢霉菌株F24和G12进行原生质体融合,再采用双灭活或流式细胞分选法筛选优良性状相结合的高产菌株,对双亲菌株原生质体的制备、融合和再生的相关条件进行了研究,并对双灭活和流式细胞分选的具体方法进行了研究.经研究发现,采用培养16 h的高山被孢霉菌丝于混合酶液(蜗牛酶15.0 mg·m L~(-1)、纤维素酶6.0 mg·m L~(-1)、溶菌酶0.5 mg·m L~(-1)和几丁质酶0.2 mg·m L~(-1))中30℃酶解4 h为原生质体制备的最佳条件.并探究得出两种融合子筛选方法的最佳方案,成功筛选出融合子,进一步再生培养验证ARA产量,最终挑选出一株ARA产量达6.32 g·L~(-1)的高产菌株.以前尚未发现此方法在高山被孢霉上的应用,为高山被孢霉育种提供了一种有效的手段.     

链霉菌种间原生质体融合的研究(Ⅱ)——融合子56-2菌株的鉴定

通过金霉素链霉菌和龟裂链霉菌原生质体融合选育出的融合子５６－２菌株，其酯酶同工酶谱与双亲有显著差异，产抗生素能力及遗传稳定性均优于金霉素链霉菌３＃，发酵产物四环素符合中国药典的各项指标，并具有抗噬菌体Ｐ５，Ｐ８的能力。     

酯酶同工酶技术在选育Bt新菌株中的应用

研究了苏云金杆菌亲本菌株及通过原生质体融合而获得的融合子的酯酶同工酶谱，通过比较分析，融合子的酯酶同工酶谱较之亲本菌株有显著变化，表明酯酶同工酶在原生质体融合中可作为鉴定融合子的遗传标记     

L－谷氨酰胺生产菌定向选育的初步研究

以天津短杆菌ＴＧ－８６６为出发菌株，利用亚硝基胍、硫酸二乙酯等常规诱变方法以及原生质体融合法最终筛选出一株谷氨酰胺生产菌ＧＭＮ－１８［ＭＳＯ~Ｒ＋８－ＡＧ~Ｒ＋ＳＧ~Ｒ＋（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４~Ｒ］，在适宜条件下平均积累谷氨酰胺２７．３ｇ／Ｌ。