日本蛇根草Actin基因片段的克隆及其序列分析

为研究日本蛇根草功能基因的表达提供内参基因,笔者参照GenBank中桔梗的肌动蛋白基因(Actin)序列设计引物,以日本蛇根草的cDNA为模板,通过RT-PCR方法成功克隆获得日本蛇根草Actin基因片段,并将其命名为OjActin(OjActin片段长469 bp)。功能保守域分析显示OjActin归属于Actin超家族,与其他植物Actin的氨基酸序列同源性达94%以上;系统进化树分析显示,OjActin与咖啡的亲缘关系最近。     

山楂Actin基因片段克隆及序列分析

依据GenBank中已知的蔷薇科梨属Actin基因的保守序列设计1对特异性引物,以山楂叶片总DNA和总RNA为模板,分别利用PCR和RT-PCR技术从山楂中克隆得到Actin基因的DNA片段和cDNA片段,测序得到山楂Actin基因DNA片段长度为1 578 bp,cDNA片段长度为1 005 bp,编码334个氨基酸。生物信息学软件分析表明,该核苷酸序列与苹果、梨、桃的Actin基因同源性较高,分别为98%,97%,95%,而编码的氨基酸序列与苹果、梨、桃则完全相同,属间具有很好的保守性。试验克隆得到的基因为山楂Actin基因,命名为CpActin。进化树分析结果进一步表明,该Actin序列与苹果、梨、桃和草莓等亲缘关系最近;半定量RT-PCR结果显示,CpActin在山楂的叶片、花柱和花粉中能够稳定表达,可作为山楂的内参基因。     

枇杷番茄红素β环化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物番茄红素β环化酶（LYC）基因的保守区序列，设计1对PCR引物，以枇杷基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增长约300bp的DNA片段，克隆人pMD-18T载体，测得该基因片段长312bp，编码102个氨基酸，属于开放阅读框的一部分，不含内含子。在GenBank中进行同源性检索表明该序列与苹果番茄红素β环化酶基因同源性为97％，由此推测这个基因属于枇杷番茄红素β环化酶基因。     

玉米PDE191基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

为研究玉米白化相关基因PDE191序列信息和基因功能,以玉米叶片总RNA逆转录后的c DNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出玉米PDE191基因全长c DNA。DNA测序及生物信息学分析表明,玉米PDE191基因c DNA全长1229 bp,编码333个氨基酸的蛋白质,亚细胞定位于线粒体和叶绿体。软件预测PDE191蛋白分子量为37.79 k D,理论等电点为9.12,该蛋白二级结构主要构成元件为?螺旋和无规则卷曲,包含7个MTERF结构域。三级结构预测显示该蛋白为球状结构,预测结果与二级结构预测的结果相符。对该蛋白进行多重序列比对和聚类分析显示,PDE191属于植物MTERF家族,在不同植物中存在其同源蛋白质,其中与拟南芥PDE191氨基酸序列的相似性高达99%。本研究为进一步研究玉米PDE191基因的功能奠定了基础。     

桃抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已克隆的STK类抗病基因的保守区设计简并引物对4个不同桃的基因组DNA进行PCR扩增,将获得的扩增片段的回收产物,应用pGEM-T easy裁体试剂盒进行了目的基因片段的克隆.随机挑取若干单克隆经PCR鉴定确认后,进行测序,共获得11个各不相同的片段序列.氨基酸序列分析中,有6个片段能推导出完整的氨基酸序列.除了两侧都基本具有STK类抗病基因产物的保守结构域.     

黑子南瓜中STK类抗病基因同源序列的克隆及序列分析

 黑子南瓜是一种具有较强抗病性的葫芦科植物,依据所克隆的植物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因中的保守氨基酸序列合成相应的简并引物,从黑子南瓜基因组DNA中通过PCR克隆到了一些STK类的R-片段,经相关软件分析发现其中之一可以编码完整的氨基酸序列,可能来源于黑子南瓜中某个抗病或抗病相关基因.该基因片段与来源于其他已知基因的相应序列比较发现同源性都比较低,属于一个新的STK类R-片段家族成员.从黑子南瓜中克隆STK类片段,将为进一步从该植物材料中获得STK类抗病基因提供新线索.     

日本沼虾感光器Gqα基因的扩增及分析

采用分子生物学方法，提取日本沼虾感光器的总RNA，反转录成c DNA。根据Gq蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，通过巢式PCR扩增出日本沼虾感光器Gqα基因的片段，并将该片段克隆到pMD 18-T载体上进行序列测定，结果显示此基因片段由369bp组成。翻译成氨基酸序列（123aa），Blast搜索结果比较该片段氨基酸序列与美洲鲎、美洲龙虾、冈比亚按蚊等6种动物的Gqα氨基酸保守序列具有高度同源性（83.74％～95％），其中与冈比亚按蚊的Gqα氨基酸序列同源性最高（95％）。     

阳春砂磷酸甲羟戊酸激酶的基因克隆与表达谱分析

目的:为了了解阳春砂磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的功能与表达特性,根据阳春砂的转录组注释设计引物,PCR克隆阳春砂甲羟戊酸途径中的关键酶磷酸甲羟戊酸激酶基因的编码区c DNA,使用生物信息学方法对其编码的蛋白进行相似性检索及同源序列比对,构建进化树,预测二级及三级结构并分析其功能,探索其各器官中的表达差异.结果:获得了全长1 539 bp的编码阳春砂PMK的c DNA序列,命名为Av PMK(Gen Bank登录号:KF569902),编码由512个氨基酸组成的磷酸甲羟戊酸激酶,该蛋白含有GHMP激酶超家族特异的N-保守区域、C-保守区域和ATP结合位点Gly-X-Gly-XX-Ala.Av PMK与其他植物的PMK氨基酸相似性达61%~69%,进化树结果显示其与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等单子叶植物具有较近的亲缘关系.Av PMK蛋白包含14个α-螺旋(Alpha helix),占37.1%;16个β链(Beta strand),占15.6%;32个无规则卷曲结构,占47.3%,无跨膜结构域,其3级结构含有一个催化反应的口袋状结构域.实时荧光定量PCR结果显示Av PMK基因在叶中表达量较高,茎、根中表达量相对较低.结论:首次从阳春砂仁中扩增磷酸甲羟戊酸激酶的基因片段,为分析其基因表达特性及其在砂仁萜类生物合成中的功能奠定基础.     

阳春砂HMGR基因cDNA克隆及生物信息学分析

目的:克隆阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的编码区c DNA.方法:根据阳春砂叶片转录组得到的HMGR基因序列自主设计引物.用改良的CTAB法提取阳春砂叶片总RNA,反转录得到c DNA,以c DNA为模板通过PCR反应扩增阳春砂HMGR基因并克隆到p MD-18T载体,将获得的阳性克隆进行测序分析.运用生物信息学方法分析得到的c DNA序列.结果:成功扩增出全长1 716 bp的c DNA片段,将其成功克隆进入p MD-18T载体,测序后将序列提交至Gen Bank得到其编号KU572444.生物信息分析结果显示,该基因片段编码1个由571个氨基酸残基组成HMGR蛋白.HMGR二级结构主要由43.95%的α-螺旋和47.29%的β-转角组成,同时还含有8.76%的β-折叠.与其他植物该蛋白质序列同源性及进化树分析结果表明,阳春砂HMGR与小米(Setaria italic)的同源性最高,且阳春砂与单子叶植物聚为一类.结论:从阳春砂叶片中成功克隆HMGR基因并进行了生物信息学分析.     

棉蚜Para钠通道cDNA和基因组DNA片段的克隆和序列分析

采用降落 PCR技术 ,根据昆虫 para型钠通道 区 S4至 S6及 与 连接区的保守区域设计简并引物 ,成功地克隆了棉蚜 para型钠离子通道 c DNA和基因组 DNA片段 (Gene Bank登录号分别为 :AF4 114 5 5、AF4 475 74 ) ,其中 c DNA片段为 6 5 9bp,编码 2 2 0个氨基酸。利用 c DNA片段设计特异性引物克隆获的基因组DNA片段为 132 8bp,共有 2个内含子。Blast序列分析表明 ,PCR扩增获得的棉蚜 para型钠离子通道 c DNA片段所编码的氨基酸与其他昆虫的 para型钠通道氨基酸具有很高的同源相似性 ,与马铃薯甲虫、德国小蠊、果蝇和家蝇的同源性分别为 6 5 %、6 3%、6 3%、5 9%。棉蚜 para型钠离子通道 c DNA和基因组 DNA片段的克隆对于农药分子设计与害虫抗性机制 ,特别是靶标抗性分子监测具有重要意义。     

荔枝R基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因（R基因）编码的蛋白质NBS保守区设计特异简并引物，对荔枝的基因组DNA进行体外扩增，获得了一条大小约500bp的扩增谱带；回收该特异扩增带并进行克隆，筛选若干阳性克隆进行测序，共获得5个片段的序列。同源性比较发现，该5个片段均属于NBS－LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为13.5%-45.9%。这些RGA既可进一步用于筛选荔枝的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于荔枝遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术可望成为荔枝抗病基因克隆和基因组研究的重要手段。     

盐生盐藻肌动蛋白基因及其5′上游片段的克隆

在盐生盐藻 c DNA文库和基因组文库中对肌动蛋白基因进行了筛选 ,结果得到了一个c DNA克隆和两个基因克隆 ,并进一步从基因克隆中克隆出该基因的 5′上游片段 .检索结果表明 ,所得到的 c DNA和基因属于盐生盐藻的肌动蛋白基因 .通过将盐生盐藻肌动蛋白基因序列同其c DNA序列及其他生物的肌动蛋白序列相比较 ,给出了一个此基因 5′上游区大概的结构     

人Kai-1基因真核表达载体的构建及其体外表达

克隆人Kai-1基因,构建其真核表达载体,并在体外细胞系中进行表达验证。提取人正常肝细胞系HL7702的总RNA,通过RT-PCR其反转录为c DNA;以该c DNA为模板,通过PCR扩增出Kai-1基因的编码区,将该目的片段纯化后亚克隆入真核表达载体pc DNA3.1myc-his(-)中,利用菌落PCR及DNA测序分别对Kai-1基因编码区的大小及序列进行鉴定。将所构建的重组质粒通过脂质体瞬时转染Hela细胞,48 h后裂解细胞,利用Western blot检测有无目的蛋白的表达。测序证实所克隆的Kai-1编码区c DNA正确地插入pc DNA3.1myc-his(-)中,经Western blot检测证实其在Hela细胞中得到表达。成功克隆了人Kai-1 c DNA,构建了其真核表达载体,并在Hela细胞中得到有效表达,为进一步研究Kai-1的功能奠定了基础。     

甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV）gp 37基因的克隆及序列分析

通过鸟枪法克隆了甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV)基因组DNA EcoR I酶切的2．2kb片段,序列分析表明,该片段含有gp37基因,SeMNPV gp37基因的开放阅读框为801个核苷酸,编码268个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为30400,在gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期基因启动子序列ATAAG,同其它昆虫杆状病毒和昆虫痘病毒GP37／Fusolin蛋白的比较结果表明,SeMNPV GP37与已知gp37/fusolin基因的氨基酸序列同源性较高（50－68％）,在其蛋白序列内存在类似的保守区和可能的N－连接糖基化位点,在SeMNPV gp37基因下游存在一个完整阅读框和部分get基因序列。     

夏威夷椰子超氧化物歧化酶基因片段的克隆与序列分析

以热带植物夏威夷椰子(Chamae doreacostricana)基因组DNA为模板,根据SOD基因保守序列设计特异引物进行PCR扩增,得到特异基因片段.回收该基因片段,与pMD182T载体连接,并转化到感受态大肠杆菌ER2566细胞,获得Cu*Zn-SOD基因片段的克隆.序列分析表明夏威夷椰子Cu*Zn-SOD基因片段含3个外显子和3个内含子,编码64个氨基酸,与玉米、红薯和白杨相应氨基酸序列的同源性分别为82.81%,81.25%,81.25%和79.69%.     

三叶青两个肌动蛋白基因片段的克隆及其分析

根据GenBank中登录的植物肌动蛋白保守序列设计1对引物,对三叶青的块根进行RT‐PCR ,在1次扩增中得到2个不同的肌动蛋白基因片段,分别命名为 ThAct1和 ThAct2．测序结果显示：ThAct1基因片段长度为867 bp ,编码252个氨基酸;ThAct2基因片段长度为1079 bp ,编码152个氨基酸．经Blast分析,ThAct1和ThAct2基因均属于NBD＿sugar‐kinase＿HSP70＿actin superfamily家族,与其它物种Actin基因序列和编码的蛋白质均具有同源性．RT‐PCR结果初步表明：在茎、普通根和块根中 ThAct1和 ThAct2基因的表达未见差异;但在叶中,ThAct1的表达稍强,而 ThAct2的表达稍弱．另外,在茎、普通根和块根中,ThAct1表达比ThAct2强;但在叶中 ThAct1表达比ThAct2弱．结果为分析肌动蛋白基因在三叶青块根发育中的功能奠定了基础;获得的肌动蛋白也可以作为内参基因,在三叶青功能基因组的研究中用于其它基因的定量表达分析．     

内生枯草芽孢杆菌HD-1β-甘露聚糖酶基因的克隆及结构生物学分析

采用PCR技术从一株内生枯草芽孢杆菌HD-1基因组DNA中扩增出β-甘露聚糖酶基因核苷酸编码序列.序列分析表明,该基因全长1 089bp,编码362个氨基酸和一个终止密码子,N端前27个氨基酸为其信号肽.该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露糖苷酶同源性最高达98.34%,具有ManB保守结构域,属于糖苷水解酶家族26的一员.通过对该酶分子三维结构的预测分析,该酶的催化域形成TIM桶状结构,Cys92和Cys112形成二硫键,它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心,Glu100和Glu292分别为该酶的酸碱催化位点和亲核催化位点.三维结构的分析为提高酶的催化活性的和功能方面的定向改造提供了依据.     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

黄鳝性别决定与SRY基因不相关

以人和鼠的SRY片断为探针与黄鳝基因组DNA进行杂交,发现雌雄黄鳝中均有相同的杂交带.用一对SRY基因保守区HMGbox的引物,在雌雄黄鳝的基因组DNA中均扩增出约200bp片段.将此片断克隆测序后发现雌雄个体中此片断仅相差1个bp,且与人的SRY基因HMG盒基因极相似.以该片段与雌雄个体的RNA进行Northern杂交未能检测到杂交带,RT-PCR反应扩增出一条微弱的200bp片段.以上结果表明:在雌雄黄鳝的基因组DNA中均存在SRY同源片断;黄鳝中的SRY同源片断可能与其性别无直接关系,而是具备其他功能,由此推测低等脊椎动物的性别决定可能由其他基因控制.     

耐热碱性磷酸酯酶基因的DNA序列分析

从栖热菌中克隆到产耐热碱性磷酸酯酶（FD－TAP）基因并进行了DNA序列分析,结果表明此2．0kb的片段含有一个1056bp的开放阅读框,编码501个氨基酸的蛋白质,其N端有一26个氨基酸的信号肽．在起始密码子的上游5bp处有一个5＇－GGAGGT－3＇的SD序列．基因编码区的（G＋C）％为68．7％,第3位密码子（G＋C）％为92．7％．FD－TAP的氨基酸序列与大肠杆菌等生物的碱性磷酸酯酶氨基酸序列比较,相同性为27％,相似性为38％．中央β－折叠区及与活性中心相关的氨基酸残基高度保守．表明FD－TAP具有与大肠杆菌碱性磷酸酯酶相似的结构和作用机制．在相当于大肠杆菌碱性磷酸酯酶的His370至His412两个金属离子结合部位之间,FD－TAP有一72个氨基酸的插入片段,提示该插入片段与FD－TAP的高耐热性相关．