重组毕赤酵母体系生成PlUGT1蛋白适宜条件研究

通过单因素试验分别研究pH值和温度对重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1生长以及甲醇浓度、pH值和温度对诱导表达PlUGT1蛋白的影响.结果表明,pH6.5和30 ℃是培养重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1最佳的生长条件,重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1诱导表达蛋白的适宜条件为甲醇体积分数0.5%、30 ℃和pH5.0,该条件下培养72 h,培养液中的蛋白质量浓度为0.721mg/mL.     

重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析

建立稳定有效的细胞壁蛋白(CWPs)抽提方法,是开展毕赤酵母细胞壁蛋白质组学及甲醇代谢调控相关性研究的基础.为此,以具重组非共价结合壁蛋白Flo1p絮凝素的酵母GS115/KFS-CALB、具共价结合壁蛋白α凝集素的酵母GS115/KNS-CALB和具重组共价结合壁蛋白Pir1的酵母GS115/Pir1-CALB为对象,用热十二烷基磺酸钠(SDS)、昆布多糖酶、氢氟酸吡啶和温和碱水解对上述壁蛋白进行抽提,结果表明:3种壁蛋白已成功地展示于毕赤酵母细胞壁的表面;用这3种毕赤酵母锚定蛋白展示脂肪酶,对细胞的生长状况影响不大,而对展示酶的表达量影响较大,GS115/KFS-CALB、GS115/KNS-CALB和GS115/Pir1-CALB的脂肪酶水解比酶活最高达855.02、1239.40和210.47 U/g(以干细胞计);热SDS可有效抽提GS115/KFS-CALB上的Flo1p絮凝素,昆布多糖酶和氢氟酸吡啶可释放GS115/KNS-CALB上的α凝集素,而昆布多糖酶和温和碱可释放GS115/Pir1-CALB上的Pir1.     

HIV-1外膜蛋白gp120在酵母Pichia pastoris中的表达

目的 用巴斯德毕赤酵母系统表达HIV外膜糖蛋白gp120.方法 将从HIV-1型国际标准株pHXB2-gp160的基因序列中扩增出的gp 120分子的长片段基因(1 419 bp)和短片段基因(417bp)分别克隆入真核表达载体pPICZαA与pPICZB中,以电穿孔法转化酵母GS 115.用YPDS-zeo平板筛选重组子、PCR方法检测整合到酵母菌GS 115基因组中的gp 120片段基因,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.结果 诱导后gp 120短片段多肽在GS 115中少量表达,在诱导表达24 h重组蛋白表达量及抗原性达到最高,表达产物被降解,具有良好的抗原特异性.诱导后gp 120长片段多肽未被GS 115所表达.结论 在巴斯德毕赤酵母中成功表达gp 120分子长片段需要优化gp 120基因,为制备HIV-1的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础.     

胸腺肽α1在毕赤酵母中的表达及纯化

采用基因工程菌发酵制备胸腺肽α1(Tα1).将人工合成的Tα1单体基因,连接到pPIC9K质粒上,构建表达载体pPIC9K-Tα1,转化毕赤酵母GS115,重组菌经甲醇诱导表达,取发酵液上清,过DEAE52、Sephade-xG-25柱纯化后获得目的蛋白.Tricine-SDS-PAGE和HPLC结果表明Tα1基因在毕赤酵母中得以表达,表达量为4.8mg/L.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

毕赤酵母中人Ⅲ型胶原蛋白α链与病毒羟脯氨酸酶的共表达

将人Ⅲ型胶原α链与一种来源于病毒的4-羟脯氨酸酶在毕赤酵母中共表达,以获得能满足应用需求的羟基化胶原蛋白。分别构建包含酶与胶原基因的重组质粒p PICZBL593和pPIC9K-COL3A1,并将质粒均转入毕赤酵母GS115中以表达这两种蛋白。质粒测序结果表明目的基因成功插入到载体中;实时定量PCR结果显示两种基因均在mRNA水平表达;SDS-PAGE和Western Blot进一步证实两种蛋白在毕赤酵母GS115中的成功表达;氨基酸组成分析和质谱结果证实表达的胶原中含有羟脯氨酸。获得羟基化的胶原蛋白。     

小麦内质网氧化还原酶在毕赤酵母中的表达

为开发健康天然的新型酶制剂型面粉改良剂,利用毕赤酵母重组表达了小麦内质网氧化还原酶1(wEro1);将wero1基因亚克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα A,实现了wEro1在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的分泌表达,优化诱导表达条件后wEro1的产量可达(53.24±2.11) U/mL;应用硫酸铵沉淀和阴离子交换层析纯化了wEro1,对电泳纯wEro1进行酶学性质研究.结果表明:wEro1具有催化二硫键异构酶(PDI)的巯基氧化活性,且最适pH为7.5,最适温度为30℃;在低温和中性pH条件下,该酶具有较好的稳定性.将毕赤酵母重组wEro1添加到面粉中,考察其对面粉加工品质的影响,发现毕赤酵母重组wEro1改善面粉粉质特性的能力比大肠杆菌重组wEro1更强.     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

重组鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

为探索ChMIL18-HN在毕赤酵母中最适宜的表达条件,采用小型摇瓶培养系统,通过对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在不同诱导时间、培养液pH值、甲醇诱导剂剂量及培养温度的条件下表达目的蛋白的分析,以对其表达条件进行优化。结果表明:重组菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在pH6.5,甲醇诱导浓度为1.5%,培养诱导温度为30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高。     

不同载体-宿主菌组合对重组蛋白表达量的影响

研究了不同载体-宿主菌组合对毕赤酵母重组蛋白表达量的影响。以豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)与ONC的融合蛋白即HSA-(Gly_4Ser_1)_3-ONC(简称HSA-ONC)等5种重组蛋白为报告蛋白,设计并合成了5种基因。分别插入3种酵母表达载体p PIC9、p PIC9K和p PICZα-A中,转化3种毕赤酵母受体菌X-33、GS115和SMD1168。筛选得到7种载体-宿主菌组合,在摇瓶规模进行诱导并定量。研究结果表明:5种外源蛋白在p PICZα-A/X-33组合中表达量最高,在p PIC9/SMD1168组合中最低。从重组蛋白表达量来说,p PICZα-A/X-33组合优于其他6种载体-宿主菌组合。     

一种新型抗菌肽Hydramacin-1在毕赤酵母中的重组表达、纯化及其抗菌活性

Hydramacin-1是来源于大乳头水螅(Hydra)的上皮防御组织的具有广谱抗菌特性的新型抗菌肽.本研究构建了外泌型重组酵母表达载体pPICZαA-Hydramacin-1,再将线性化的重组表达载体pPICZαA-Hydramacin-1电转入毕赤酵母宿主菌(Pichiapastoris)GS115中,成功构建了重组毕赤酵母表达菌株.在培养温度为28℃、甲醇体积分数为1.5%、诱导表达时长为120 h时,蛋白表达量达到最高,重组抗菌肽Hydramacin-1的表达量可达83 mg/L.经阳离子交换柱纯化,每升发酵液可得到约9 mg纯度为90%的重组抗菌肽Hydramacin-1.经最小抑菌浓度的测定,制备的重组抗菌肽具有广谱抗菌特性,相比于革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌对此抗菌肽更为敏感.本实验将Hydramacin-1抗菌肽首次成功地在毕赤酵母中高效表达,为以后该抗菌肽的理论研究和应用奠定了基础.     

毕赤酵母工程菌发酵生产重组Cu/Zn-SOD的工艺研究

系统考察毕赤酵母工程菌GS115表达重组铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的发酵工艺参数,优化后5 L发酵罐上生产工艺为:采用BSM培养基,接种量5%(体积分数),发酵温度35℃,诱导期搅拌转速900r·min-1,pH值为6.0、维持溶氧(DO)水平为饱和值的20%以上.经过142 h发酵实验,SOD活力最高可达102.789 kU·mL~(-1),比优化前提高3.5倍.采用毕赤酵母工程菌能实现高效、大量制备优质动物来源的Cu/ZnSOD重组蛋白,具有良好的产业化潜力和广泛的应用前景.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据GenBank中aiiA基因设计引物,以苏云金芽孢杆菌基因组为模板扩增出aiiA基因后构建出pPIC9K-aiiA重组表达载体,线性化后转化毕赤酵母GS115,获得重组工程菌GS115/pPIC9K-aiiA,以体积分数为1%的甲醇进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE及Western blotting分析显示表达的蛋白具有较好的免疫特异性.抗病性实验显示表达的目的蛋白具有生物学活性和良好的抗病能力.     

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达

研究阿魏酸酯酶O42807基因(fae)在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达及重组阿魏酸酯酶的酶学特性.化学合成fae基因序列,构建分泌型重组质粒pPIC9K-fae,经线性化后电转化至毕赤酵母GS115,对筛选出的高活性转化子进行诱导表达.SDS-PAGE分析显示:发酵上清液为单一条带,表观相对分子质量为42 ku,酶活为78.49 nkat·mL^-1,比活力为524.38 nkat·mg^-1,最适反应温度为50 ℃,在40~45 ℃温度范围内较稳定,最适反应p     

枯草芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因序列设计引物,以pHBM003为模板,扩增得到寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因,克隆至毕氏酵母（Pichia pastoris）表达载体pHBM905上,获得重组毕氏酵母表达载体pHBM9053．将此质粒分别转化毕氏酵母GS115、KM71和SMD1168菌株,筛选获得重组毕赤酵母GS115（pHBM9053）、KM71（pHBM9053）和SMD1168（pHBM9053）;然后进行摇瓶诱导培养,这3株毕氏酵母分别在诱导培养60h、48h和24h后,酶活力达到最高,对应为2．233u／mL、0．34u／mL和1．235u／mL;GS115（pHBM9053）所产寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的最适反应温度为75℃,最适反应pH值为6,在30～75℃、pH8～9范围内较稳定．     

紫球藻藻红蛋白α、β亚基在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达

将紫球藻藻红蛋白α、β亚基基因(pe A、pe B)分别插入到毕赤酵母表达载体p AO815和大肠杆菌表达载体p ET-28a中.重组的共表达载体p AO815-pe A-pe B转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,经甲醇诱导、SDS-PAGE电泳及DOT-BLOT分析,发现藻红蛋白表达量低.p ET28a-pe A、p ET28a-pe B表达载体分别转入E.coli BL21,经IPTG诱导,Western Blotting分析,结果显示在约20.1 ku处有特异性蛋白条带,与融合蛋白(Pea-his、Peb-his)预期大小基本一致.     

RGD-拖丝蛋白基因的构建及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据天然拖丝蛋白的高度重复性序列,引入与细胞黏附有关的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列,以毕赤酵母偏好的密码子化学合成RGD-拖丝蛋白基因单体,通过"头尾相连"的多聚化策略,倍加成16聚体与32聚体基因.分别将这两种多聚体与分泌型表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,用G418筛选毕赤酵母重组菌.通过甲醇诱导表达,培养液上清的SDS-PAGE分析表明RGD-重组拖丝蛋白获得分泌型表达.