血栓纳米抑制剂m_(5k)-BAD-L的构建及其性能研究

抗血栓药物种类繁多,但主要以血液中血小板和凝血因子为靶点,因而可能破坏正常凝血系统平衡而导致出血风险.针对该问题,前期以胶原蛋白为靶点,通过仿生设计已获得七肽LWWNSYY,经实验验证该七肽能够抑制血小板表面整联蛋白α_2,β_1与胶原蛋白的结合,从而抑制血小板的黏附及后续血栓形成.但是,LWWNSYY的疏水性较高导致其生物利用度较低.因此,利用两亲性的单甲氧基聚乙二醇-丁醛(m_(5k)-BAD)修饰LWWNSYY,构建血栓纳米抑制剂m_(5k)-BAD-L,并考察其与胶原蛋白的结合特性以及抑制血小板黏附的实际效果.结果表明,m_(5k)-BAD-L能有效改善LWWNSYY的生物利用度,且有效结合胶原蛋白,Kd为(0.60±0.28),μmol/L,因而有效抑制血小板黏附.研究结果有助于推动新型血栓纳米抑制剂的开发和利用.     

罗非鱼脯氨酸内肽酶的分离及抑制剂对其的作用机制

采用硫酸铵盐析及柱层析技术,从罗非鱼肌肉中分离纯化得到分子质量约为85 ku的脯氨酸内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)。通过肽质量指纹质谱分析,获得13个肽片段,含128个氨基酸残基,结果显示,与伯氏朴丽鱼(Haplochromis burtoni)的PEP完全一致。该酶特异分解荧光底物Suc-Gly-ProMCA和Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA,PEP特异性抑制剂SUAM-14746和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF可以抑制该酶的活性。PEP催化Suc-Gly-Pro-MCA水解反应的活化能(Ea)为47.42 k J/mol。SUAM-14746对PEP表现为竞争性抑制作用,抑制常数(KI)为1.91μmol/L。金属离子Zn~(2+)和Cu~(2+)对PEP的抑制类型均为混合型抑制,其中对游离酶的抑制常数(KI)分别为1.80 mmol/L和0.07 mmol/L,对酶-底物络合物的抑制常数(KIS)分别为2.33 mmol/L和1.17 mmol/L。     

CFTR对肺腺癌细胞Calu-3迁移影响的研究

采用常规培养肺腺癌细胞Calu-3的方法,利用MTT和CCK-8法确定囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)的激活剂(Genistein)和抑制剂(CFTRinh-172)的最适浓度,用CFTR激活剂和抑制剂的最佳浓度分别处理Calu-3细胞,然后采用划痕实验观测了培养48h后Calu-3细胞迁移的差异.结果表明:MTT法检测激活剂的最佳浓度为25μmol/L;CCK-8法检测抑制剂的最佳浓度为10μmol/L;划痕实验检测得出25μmol/L激活剂组细胞迁移数量((74.2±5.79)个)与对照组细胞迁移数量((134.1±10.04)个)相比具有显著性差异(P=0.000.01);10μmol/L抑制剂组细胞迁移数量((148.3±17.70)个)与对照组细胞迁移数量((134.1±10.04)个)相比无显著性差异(P=0.270.05).激活剂通过促进CFTR氯离子通道的开放,抑制了肺腺癌肿瘤细胞Calu-3的迁移.     

以柯萨奇B3病毒3C蛋白酶为靶点的体外药物筛选模型的建立及应用

建立以柯萨奇B组3型病毒3C蛋白酶(CVB3-3C)为靶点的药物筛选模型,并筛选新型抑制剂。使用原核表达模型实现CVB3-3C蛋白酶体外重组表达。经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析纯化获得高纯度CVB3-3C蛋白。应用荧光共振能量转移法检测蛋白酶活性,建立药物筛选模型。对768种化合物进行筛选,获得了2种对CVB3-3C蛋白酶有较强抑制作用的化合物(MDCE-A008和MDCE-A043),IC50值分别为(60.61±6.26)μmol/L、(105.7±14.88)μmol/L。建立的CVB3-3C蛋白酶药物筛选模型为获得有效抑制剂提供了技术保证。     

褶牡蛎氨肽酶B的分离纯化和性质研究

氨肽酶是一类能特异水解蛋白质N端氨基酸残基的外切酶,在食品行业有着广阔的应用前景。以褶牡蛎(Alectryonella plicatula)为原料,通过硫酸铵盐析,DEAE-sepharose,phenyl-sepharose及羟基磷灰石柱层析,分离纯化得到了一种高效水解碱性氨基酸的氨肽酶,其活性能被氨肽酶特异性抑制剂bestatin有效抑制。双向电泳结果显示该酶的分子质量约为100ku,pI约为5.8。通过肽质量指纹图谱对其进行鉴定得到12个肽段,共含138个氨基酸残基,这些氨基酸序列与太平洋牡蛎中嘌呤霉素敏感性氨肽酶一致,表明纯化的酶为氨肽酶B。褶牡蛎氨肽酶B的二级结构以无规卷曲与反向平行为主,其中无规卷曲占42.6%,反向平行占32.0%。动力学研究获得其K_m和k_cat值分别为1.5μmol/L和117.5s-1,k_cat/K_m为78.3L/(μmol·s)-1。在35℃,pH值 7.0的条件下,该酶具有最大催化活性,能高效水解氨肽酶底物Lys-MCA和Arg-MCA,释放出游离态的Lys和Arg,推测与牡蛎呈味相关。     

糯米酒发酵过程中微生物基因组提取方法比较

为了更加快速地获得糯米酒发酵过程中高质量的微生物基因组DNA,本实验通过测定基因组DNA浓度和进行聚合酶链式反应(PCR),利用溶菌酶-SDS-蛋白酶-K(A法),改良CTAB(B法)和改良CTAB-溶菌酶(C法)三种实验方法获得微生物基因组DNA,通过比较三种方法发现,C法提取效率最高,获得的基因组DNA浓度为1 573.97±711.51ng/μL;B法获得的基因组浓度为1 436.03±128.0ng/μL;A法效率最低,获得基因组浓度为411.67±133.29ng/μL.以基因组DNA为模板进行PCR,将扩增产物在0.6%琼脂糖凝胶中进行电泳检验.结果显示C法获得的条带最清楚明亮,表明DNA浓度最高、结构完整.基因组DNA浓度和PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带的亮度表明,提取糯米酒发酵过程中微生物基因组DNA的最优方法为改良CTAB-溶菌酶法(C法).     

膜片钳全细胞记录法在研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制中的应用

为了研究中性氨基酸转运蛋白-谷氨酰胺转运蛋白的结构与功能,采用膜片钳全细胞记录法测定谷氨酰胺转运蛋白2介导的电流.结果表明:谷氨酰胺转运蛋白诱导了底物氨基酸和Na+浓度依赖性电流,可用于测定底物氨基酸和Na+对转运蛋白的表观亲和常数Km,SNAT2野生型对丙氨酸的表现亲和常数KmAla为(200±5)×10-6mol/L,对Na+的表观亲和常数KmNa为(100±7)×10-3mol/L.谷氨酸转运蛋白转运底物氨基酸过程是生电的过程,在膜电势负值时氨基酸转运电流增大,可用于转运机制的研究.因此膜片钳全细胞记录法是研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制的有效方法.     

安氏伪镖水蚤精氨酸激酶cDNA的克隆及镍胁迫下的表达特性

为探讨镍胁迫对桡足类影响的分子机制,以安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)为研究对象,采用cD-NA末端快速扩增技术(RACE)方法获得了安氏伪镖水蚤精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)cDNA全序列,全长1 180bp,开放阅读框1 068bp,编码355个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为39.43ku.Blast分析结果显示,安氏伪镖水蚤AKcDNA与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、多齿新米虾(Neocaridina denticulata)和光滑双脐螺(Bi-omphalaria glabrata)AK基因具有较高的同源性(77%～82%).荧光定量PCR结果显示:低质量浓度镍(10μg/L)对AK转录水平呈现峰值效应,高质量浓度(40和500μg/L)镍则对AK呈现抑制效应,表明AK与安氏伪镖水蚤响应重金属胁迫密切相关.本研究为揭示镍胁迫对桡足类的影响机制提供理论依据.     

麦穗鱼的血液学特征

断尾法取血对麦穗鱼进行血液研究,描述了各类血细胞并对白细胞分类计数,旨在为鱼类血液学和麦穗鱼基础生物学积累资料.结果表明:麦穗鱼多项血液学特征性别间无显著差异,其红细胞数量(2.00±0.23)×106/mm3,血红蛋白含量(64.93±6.13)g/L,血细胞压积35.89%±4.82%,平均红细胞体积(182.19±32.34)fL,红细胞平均血红蛋白含量(32.50±3.73)pg,红细胞血红蛋白含量(184.91±27.56)g/L.血栓细胞数量为(2.93±0.81)×104/mm3,血栓细胞计入和不计入时白细胞数量分别为(4.28±0.93)×104/mm3和(1.34±0.40)×104/mm3.     

氧化石墨烯修饰再生碳纤维微电极的新方法

采用电沉积法将氧化石墨烯修饰到已被五羟色胺(5-HT)毒化的碳纤维电极表面制得再生碳纤维电极,用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)研究了多巴胺(DA)在该再生电极上的电化学行为,并优化了氧化石墨烯的电沉积时间及电压.结果表明:在20 mmol/L,p H为7.2的Tris-HCl缓冲溶液中,该再生电极对多巴胺、去甲肾上腺素具有良好的电化学响应.在优化条件下,利用DPV测定,DA的氧化峰电流与其在0.1~100μmol/L呈良好的线性关系,检测下限达0.1μmol/L.     

LC-MS/MS法测定比格犬血浆中Epacadostat的浓度

本文旨在建立快速、灵敏、可靠的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法以测定IDO抑制剂Epacadostat在比格犬血浆中的浓度,研究其在比格犬体内的药代动力学特征.色谱柱为Waters symmetry C18 (150 mm×2. 1 mm,3. 5μm),流动相为乙腈-水(80∶20,含0. 02 mmol/L乙酸铵),流速为0. 2 m L/min,采用负离子选择性反应监测模式监测.在此实验条件下,方法的灵敏度高,专属性好,分析物在0. 025～5μmol/L范围内线性关系良好(r 0. 992 5),批内批间变异系数小于12. 5%,偏差在±5. 1%以内,该方法已成功应用于比格犬血浆中的Epacadostat药物浓度测定.动物实验结果表明,Epacadostat在比格犬血浆中的药时曲线下面积(AUC0-24)为19. 7±1. 65 h·μmol/L,末端消除半衰期为7. 05±2. 73 h.     

乙型肝炎病毒标志物与肝功能相关分析

目的探讨乙型肝炎病毒标志物与肝功能的关系.方法对比分析乙型肝炎102例病人中大三阳(HB-sAg、HBeAg、HBcAb阳性)44例、小三阳(HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性)58例的谷丙转氨酶(ALT)、谷革转氨酶(AST)及总胆红素(T-BIL)浓度及白蛋白/球蛋白(A/C)异常情况.结果大三阳组ALT为(345.72±198.40)u/L,AST为(335.63±169.61)u/L,T-BIL为(78.68±26.78)μmol/L,A/G异常率为59.09%;小三阳组ALT为(155.63±98.53)u/LAST为(161.27±89.50)u/L,T-BIL为(38.68±16.78)μmol/L,A/G异常率为29.31%.两组比较有显著性差异(P＜0.05).结论乙型肝炎的病毒标志物与肝功能损害有关,大三阳病人的肝功损害比小三阳的明显严重.     

反相高效液相色谱法评价烟台苹果中游离氨基酸

利用反相高效液相色谱法对烟台境内多地红富士苹果中游离氨基酸含量进行检测和分析.色谱条件为:Capcell PAK C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,3μm),以10 mmol/L磷酸氢二钠和10 mmol/L硼酸钠的缓冲溶液(pH 8.2)为流动相A,乙腈-甲醇-水(45∶45∶10,V/V/V)为流动相B,梯度洗脱,流速1.5 mL/min,外标法定量,检测波长为338 nm和262 nm.在10¹ 000 pmol/μL浓度范围内,17种氨基酸线性关系良好(R2>0.999),峰面积的精密度(RSD):1.47%1 000 pmol/μL浓度范围内,17种氨基酸线性关系良好(R2>0.999),峰面积的精密度(RSD):1.47%³.84%,回收率91%3.84%,回收率91%¹11%.8种烟台红富士苹果中游离氨基酸总量为47.0111%.8种烟台红富士苹果中游离氨基酸总量为47.0¹40.9μg/g,必需氨基酸的含量比例为6.6%140.9μg/g,必需氨基酸的含量比例为6.6%²9.5%,不同产地苹果中氨基酸含量在极差0.05水平上有显著性差异,对测定值分别进行聚类分析和主成分分析,8种不同产地的苹果样品可分为3类.     

基于DNA-AuNCs的荧光传感新方法灵敏检测胰蛋白酶活性

以DNA模板金纳米簇(DNA-AuNCs)作为荧光探针,发展了一种灵敏检测胰蛋白酶活性的荧光分析新方法.在胰蛋白酶存在条件下,牛血清白蛋白水解成多肽片段,释放出游离的半胱氨酸残基.半胱氨酸残基与金纳米簇通过Au-S键形成非荧光的配合物,导致金纳米簇的荧光强度显著降低.该方法对胰蛋白酶的线性检测范围为0.1～2.0mg/L,检出限为20μg/L(R_(SN)=3).此外,该方法被成功应用于人血清样品中胰蛋白酶含量的测定.     

麝香酮对姜黄素在大鼠体内药动学及脑分布的影响

建立大鼠脑组织及血浆中姜黄素及四氢姜黄素的HPLC-MS/MS检测方法,并研究麝香酮对姜黄素大鼠体内药动学及脑分布的影响.将大鼠分为姜黄素组(10 mg/kg),姜黄素与麝香酮低、高剂量(0. 8 mg/kg、1. 6 mg/kg)联合组.利用HPLC-MS/MS检测SD大鼠尾静脉注射药物后,姜黄素及代谢物四氢姜黄素在血浆和脑组织中的浓度变化,计算药动学参数.姜黄素组与香酮低剂量联合姜黄素组比较,姜黄素血浆中的药时曲线曲线下面积AUC_(0-∞)分别为(18 026. 34±3 221. 75)(μg/L)·min和(23 205. 28±2 030. 73)(μg/L)·min,血浆药物总清除率CL_z分别为(0. 57±0. 09) L/(min·kg)和(0. 43±0. 04) L/(min·kg);在脑组织中,姜黄素组与香酮低剂量联合姜黄素组比较,姜黄素的AUC_(0-t)分别为(1 508. 82±616. 03)(μg/L)·min和(200. 18±70. 87)(μg/L)·min,四氢姜黄素的AUC_(0-t)分别为(893. 33±378. 63)(μg/L)·min和(181. 39±95. 00)(μg/L)·min.结果显示,低剂量的麝香酮可以促进姜黄素在体内的吸收,并减慢姜黄素在体内的清除,但是对于姜黄素脑组织分布并没有促进作用.     

大丁草（Gerbera anandria（L．）Sch Bip．）对腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭大鼠TGF—β1和ET-1mRNA表达的影响

采用Wistar大鼠灌胃腺嘌呤4周复制慢性肾衰模型后用大丁草水煎液进行灌胃治疗,4周后检测各组肾功能、肾脏组织病理学改变及转化生长因子-β1(TGF-β1)和内皮素-1(ET-1)mRNA的表达结果发现大草组大鼠血肌酐和尿素氮浓度分别为(89.33±15.21),μmol/L和(21.52±3.95)mmol/L与治疗前的建模组(290.33±74.55)μmol/L和(32.30±2.35)mmol/L以及病理对照组(149.67±24.95)μmol/L和(33.18±2.95)mmol/L比较有所下降,经统计P<0.05,差异具有显著性与病理对照组相比大丁草组大鼠基因TGF-β1和ET-1表达也明显降低,与看家基因GAPDH的比值分别由(0.2026±0.0503)和(0.1949±0.0969)下降为(0.1285±0.0447)和(0.07810±0.0229),经统计P<0.05,差异具有显著性.由此认为大丁草对腺嘌呤所致慢性肾功能衰竭大鼠肾脏有保护作用,其机制可能是通过抑制TGF-β1和ET-1的表达来缓解肾脏损伤,恢复肾功能.     

肝再生增强因子对HepG2细胞Na+,K+-ATP酶的影响

用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检验重组肝再生增强因子(ALR)对人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)细胞的增殖作用,无机磷比色法测定细胞Na, K -ATP酶的酶活,蛋白质免疫印迹分析Na ,K -ATP酶的磷酸化情况.体外实验结果表明,重组ALR能促进HepG2细胞增殖.ALR可提高HepG2细胞Na, K -ATP酶酶活,符合M ichaelis-M enten方程作用机制,ALR提高了细胞Na, K -ATP酶的转化效率,vm ax由(0.84±0.11)μmol/(mg.m in)上升到(1.68±0.07)μmol/(mg.m in)(P<0.01,差异极显著),而Km则由(23.54±0.12)mmol/L变为(20.86±0.13)mmol/L(P>0.05,差异无显著性).丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化是酶活提高的关键因素.蛋白质免疫印迹分析也证实:ALR对Na, K -ATP酶磷酸化的影响属于剂量-时间依赖型.     

阳极溶出伏安法测自来水中痕量砷离子的研究

为采用阳极溶出伏安法(ASV)测定不同形态的砷(As),优化了pH值、沉积电位、沉积时间和支持电解质等影响因素.结果表明:该体系在1~100μg/L峰电流与As(Ⅲ)的浓度呈现良好的线性关系,相关系数为0.998,检出限为37.5 ng/L,8次重复测定10μg/L As(Ⅲ)RSD为1.27%.该方法可通过还原As(V)为更有电活性的As(Ⅲ)来实现As(V)的测定,可用于检测自来水样品中超痕量As(Ⅲ)和As(V),测定结果与电感耦合等离子质谱结果相一致,实现了不同形态砷的测定.     

采用盲孔填充技术制备金属微电极阵列

针对目前MEMS工艺里由于微电铸铸层内应力导致的金属微结构与基底容易脱离的问题和不足,提出一种借助盲孔填充技术制备微电极阵列的方法。选择KMPR作为胶模材料,首先通过UV-LIGA工艺制备出180μm厚的阵列孔缝胶模结构,然后在胶模表面溅射Cu种子层,优化电铸工艺参数:电铸前采用真空润湿的方法排出孔缝内气泡,电铸液中加速剂与抑制剂浓度分别为4×10~(-6)mol/L和24×10~(-6)mol/L,电流密度为1 A/dm~2,在孔缝内电铸铜,并在胶模表面电铸出铜基底,最后获得了高180μm,线宽200μm的两种柱状金属微电极阵列。试验结果表明,盲孔填充技术是一种低成本、安全的制作金属微电极阵列的方法。     

分子模拟研究AChE与酮类曼尼希碱衍生物抑制剂相互作用的结合机理

主要通过分子对接(autodock)、分子动力学(MD)模拟和结合自由能(MM/PBSA)计算等方法研究了3种酮类曼尼希碱衍生物抑制剂(下文它们被标记为M1、M2和M3)与AChE的结合模式和相互作用机理.分析表明,结合自由能的计算结果与实验测得的IC_(50)值结果相对应,而范德华相互作用是这3种抑制剂与AChE结合的主要驱动力.其中,M2和M3与AChE的结合模式相似,但与M1相比有些不同,这点在抑制剂与周围残基之间的能量分析上也有所体现.残基W84和E82则是区分抑制剂M1、M2和M3生物活性高低的关键性残基.