老鼠基因组盒式外显子和内含子保留型可变剪接位点预测

老鼠和人类基因组的同源性超过90%,老鼠基因组的研究为人类基因组序列研究提供了参考数据.统计分析了老鼠盒式外显子和内含子保留型剪接位点附近的序列保守性特征,并据此分别利用基于多样性指标的支持向量机和二次判别法对老鼠基因组中这两种剪接类型的供体端和受体端可变剪接位点进行了预测.独立检验结果表明,盒式外显子和内含子保留型的供体端和受体端可变剪接位点的预测均能达到较高的识别精度.     

利用分离型内含肽DnaE表达抗菌肽

拟验证天然断裂内含肽Npu Dna E、Ssp Dna E的反式剪接反应对嵌合蛋白形成的影响,探讨依据此方法表达抗菌肽的可行性,规避抗菌生物表达中对宿主的毒害作用.将花蝉属抗菌肽ADP-1(Amblyomma defensin peptide 1)拆分为N端和C端两部分,其N端与断裂型内含肽Npu Dna E的N端融合,C端与Ssp Dna E的C端融合,并分别构建到原核表达载体p ET-23a(Amp+)和p ET-30a(Kan+)上,获得重组表达质粒p ET-23a-ADP-1-N-Npu和p ET-30a-Ssp-ADP-1-C,然后单独或共转化大肠杆菌感受态细胞BL21.实验结果表明,两个重组质粒分别单独或组合转化至Bl21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测转化的菌株中都表达了目的蛋白,共转化的菌株诱导表达破菌后其上清液有抑菌活性.该实验验证以两种天然断裂型内含肽Ssp Dna E和Npu Dna E及搭载的ADP-1 N端和C端可在大肠杆菌中获得表达,且共转化的两段内含肽可在离体上清中发生反式剪接,促进融合在内含肽上的ADP-1两部分形成完整具有抑菌活性产物.     

广东汉族人群TLR9基因单核苷酸多态性及其单倍型(英文)

采用PCR扩增和直接测序法对191例健康且无血缘关系的广东汉族人群筛查了TLR9全基因序列,包括调控区、5′非翻译区、第1,2外显子、内含子及3′非翻译区上所有的单核苷酸多态性(SNP)位点.共检出五个SNP位点,分别为调控区的-1 486 T/C和-1 421 C/T、内含子区的+1174 A/G、第2外显子的+1 387 T/C和+2848 G/A,其中-1421 C/T和+1 387 T/C为首次发现的新位点.连锁不平衡分析表明-486 T/C,1174 A/G以及2848 G/A之间存在紧密连锁,并且涵盖了整个基因区域,形成了一个单倍域.在此基础上运用Hhase软件构建了TLR9基因的单倍型,共得到七种单倍型并模拟了它们可能的分布频率.进一步的中性检验表明TLR9基因在广东汉族人群中符合中性进化模式.     

选择性剪接的调控

1977年证实，典型的真核基因为断裂基因，蛋白质编码基因的初级转录产物需要通过剪接加工去除内含子并连接外显子，才能成为翻译模板。后来发现，一种初级转录产物可能有多种不同的选择性剪接方式，产生不同的成熟mRNA，导致生成多种蛋白质。在生物界选择性剪接存在广泛，直到最近人们才完全了解其普遍性和复杂性。异常剪接可能导致多种疾病。     

人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢,具有重要的生理功能.为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1基因5′端含有1～534核苷酸的cDNA序列-PIFΔC.在PIFΔC的 5′端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体,得到重组质粒pET15-PIFΔC.以此重组质粒转化RosettaTM 2(DE3)感受态细胞,使PIFΔC蛋白质在大肠杆菌中得到表达.在4℃通过快速液相色谱纯化系统,通过一系列色谱层析柱纯化了PIFΔC蛋白质.以纯化的PIFΔC蛋白质免疫家兔制备了抗血清,并检测了纯化的PIFΔC的生物化学活性.结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端,具有使单链DNA复性的特性.PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性,暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复,包括断裂的双链DNA的修复.     

Ⅱ类内含子与核mRNA前体内含子的起源

Ⅱ类内含子作为可移动遗传成分以及核mRNA前体内含子可能的祖先已引起广泛的注意 .Ⅱ类内含子作为可动因子能通过后归巢和反转录转座的机制在基因组内扩散或者侵入到新的基因组中 .从Ⅱ类内含子的分类以及对这两类内含子进行比较发现 ,它们剪接机制具有惊人的相似性 ,加之Ⅱ类内含子的移动性 ,为自我剪接Ⅱ类内含子可能是真核生物核mRNA前体内含子进化祖先的假说提供了证据 .     

人SLC25A13基因内含子突变IVS6-11A>G导致转录子剪接异常

目的:通过minigene剪接实验分析SLC25A13基因内含子突变IVS6-11A G是否导致转录子剪接异常,并确定其剪接方式,进而明确其在Citrin缺陷病的致病性.方法:构建携带突变的目的片段外显子捕获载体,转染293T细胞后逆转录PCR扩增转录产物,测序并分析.结果:IVS6-11A G突变导致SLC25A13基因内含子6的3'端10个碱基保留于转录子中,致蛋白翻译提前终止,Citrin蛋白功能丧失.结论:SLC25A13基因IVS6-11A G突变为剪接突变,其剪接方式为可变3'剪接,该突变为Citrin缺陷病致病突变.     

拟穴青蟹两个Crustin新变体的克隆与表达分析

Crustins是一类广泛存在于甲壳动物中富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽.该研究从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆获得两个Crustin新变体,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.分析显示两者的前体肽包含N-端信号肽和C-端成熟肽两部分,成熟肽均含有12个位置高度保守的半胱氨酸.SpCrus1b在信号肽和乳清酸蛋白(WAP)结构域之间存在一个半胱氨酸富集区,属于典型的Ⅰ型Crustins;SpCrus2b除具有SpCrus1b的结构特征外,在近N-端额外含有一个甘氨酸富集区,属于典型的Ⅱ型Crustins.基因组结构分析显示SpCrus1b的基因组DNA序列为4个外显子/3个内含子结构,而SpCrus2b的基因组DNA序列为2个外显子/1个内含子结构.两者均主要在鳃中表达,且在脂多糖(LPS)刺激24h和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激12h后表达量均极显著上调(p0.01),表明SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹抗细菌和抗病毒的先天免疫过程.     

大豆幼苗根系抗氧化酶活性的耐酸、铝研究

以大豆(029-289,浙春2号)为实验材料,在水培条件下,用不同量的酸、铝(T1:0 mmol·L-1 Al+pH 3;T2:0 mmol·L-1 Al+pH 4;T3:0 mmol·L-1 Al+pH 5;T4:0.5 mmol·L-1 Al+pH 5;T5:1 mmol·L-1Al+pH 5;T6:1 mmol·L-1 Al+pH 3)处理24,,61,2和24 h后,测定大豆幼苗根系的可溶性蛋白质含量与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性.结果显示:随着酸、铝处理时间的增加,大豆根系的可溶性蛋白质含量及SOD,POD和CAT的活性均呈先上升后下降的变化趋势,在酸、铝处理6 h时达到最大值,24 h时达到最小值.在无铝影响下,随着pH的升高,可溶性蛋白质含量及SOD,POD和CAT的活性先升高后降低,在T2处理下达到最大值.在pH 5条件下,随着铝浓度的增加,SOD活性先增大后减小,在T4处理下出现最大值;POD和CAT的活性随铝浓度的增加逐渐增大.在T6处理下,大豆根系SOD,POD和CAT的活性达到各酸、铝处理的最小值,说明该处理对大豆根系的伤害最大.     

黄连素抗氧化活性的研究

采用MDA测定、琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE法,检测了黄连素对由自由基引起的脂质过氧化、DNA断裂、蛋白质氧化降解的保护作用;用DMPD·+法检测了黄连素对DMPD·+自由基的清除能力.研究结果表明,黄连素有很好的抗氧化活性,并且随着浓度的升高,对脂质过氧化、DNA断裂、蛋白质氧化降解的保护作用和清除DMPD·+的能力逐渐增强.在抑制脂质过氧化中,当浓度为320 μmol·L-1时,抑制率达到95.5%.在保护DNA的氧化性损伤中,浓度为80 μmol·L-1时,具有明显的保护作用.在保护蛋白质氧化降解中,浓度达320 μmol·L-1时,保护作用明显.但对DMPD·+的清除能力较弱.当浓度为80 μmol·L-1时,清除率为1.7%.说明黄连素在不同的抗氧化体系中抗氧化活性不同.     

New components of the spliced leader RNP required for nematode trans-splicing

Pre-messenger-RNA maturation in nematodes and in several other lower eukaryotic phyla involves spliced leader (SL) addition trans-splicing. In this unusual RNA processing reaction, a short common 5' exon, the SL, is affixed to the 5'-most exon of multiple pre-mRNAs. The nematode SL is derived from a trans-splicing-specific approximately 100-nucleotide RNA (SL RNA) that bears striking similarities to the cis-spliceosomal U small nuclear RNAs U1, U2, U4 and U5 (refs 3, 4); for example, the SL RNA functions only if it is assembled into an Sm small nuclear ribonucleoprotein (snRNP). Here we have purified and characterized the SL RNP and show that it contains two proteins (relative molecular masses 175,000 and 30,000 (M(r) 175K and 30K)) in addition to core Sm proteins. Immunodepletion and reconstitution with recombinant proteins demonstrates that both proteins are essential for SL trans-splicing; however, neither protein is required either for conventional cis-splicing or for bimolecular (trans-) splicing of fragmented cis constructs. The M(r) 175K and 30K SL RNP proteins are the first factors identified that are involved uniquely in SL trans-splicing. Several lines of evidence indicate that the SL RNP proteins function by participating in a trans-splicing specific network of protein protein interactions analogous to the U1 snRNP SF1/BBP U2AF complex that comprises the cross-intron bridge in cis-splicing.     

一种自剪切内含肽重组酿酒酵母表达优化研究

自剪切内含肽纯化系统在大肠杆菌中已经得到很好的应用。为了在真核生物中应用该系统,以酿酒酵母为宿主,p HR质粒为表达载体,构建微型内含肽ΔI-CM intein酿酒酵母表达系统。以猪免疫球蛋白Ig G的Fc domain为亲和标签,绿色荧光蛋白gfp为报告蛋白,在酿酒酵母GPD强启动子作用下,表达出融合的Fc-intein-gfp蛋白。检测发现融合序列在起始密码子ATG前加入一段Kozak序列有利于gfp表达。在此基础上,将微型内含肽ΔI-CM intein序列替换成密码子优化的ΔI-CMintein-O序列,显著促进gfp蛋白的表达量,初步实现了ΔI-CM intein融合蛋白的高效表达。为新型自剪切内含肽酿酒酵母表达系统的建立和重组蛋白高效纯化的实现奠定了基础。     

内含肽介导的鼠多瘤病毒样颗粒生产表达和纯化

鼠多瘤病毒样颗粒(VLPs)可由结构蛋白VP1自组装而成,可用于疫苗开发、基因治疗、药物传递和生物材料等方面.针对目前VP1生产中需要凝血酶去除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,生产成本较高、操作复杂的问题,利用内含肽(intein)自剪切的特征,将内含肽插入到VP1与GST标签之间进行融合表达,表达产物经亲和色谱纯化,并通过改变柱内pH值、温度诱导内含肽剪切,使VP1与GST-intein分离从而获得VP1蛋白,产量为4,mg/(L培养基).纯化的VP1可自组装成与天然鼠多瘤病毒样颗粒一致的VLPs.结果表明,内含肽介导鼠多瘤病毒样颗粒生产纯化流程简单易行,且无需凝血酶参与,大幅降低成本,为VLPs的高效制备奠定了基础.     

含内蛋白子融合表达载体的构建与人神经营养因子-3的初步表达

为了构建一个含蛋白质剪接元件的表达载体 ,将 3.38kb的 p Ex Sec 的多克隆位点 (Eco R /Bam H )处插入一个含多个酶切位点的 49bp寡聚核苷酸。然后将 p MYB12 9中 intein- CBD基因片段移插入上述经改造的p Ex Sec I中 ,构建成含内蛋白子的表达载体 p Ex IC。根据人神经营养因子 - 3(h NT- 3)的已知 DNA序列 ,设计含 NdeI/Xho I酶切位点的引物 ,用 PCR法从人全血总 DNA中扩增 h NT- 3,再插入 p Ex IC载体中 ,构建成 p Ex IC- h NT- 3重组质粒。经转化后 ,工程菌 E.coli BL 2 1(DE3) /p Ex IC- h NT- 3在 L B培养基中获得融合表达 ,根据 intein的自剪切原理 ,在还原剂 DTT作用下 ,初步获得了约 14k D的 h NT- 3目的蛋白。     

新型内含肽介导PHB系统表达纯化PoIFN-α的研究

为简化猪α干扰素蛋白（PoIFNα）的纯化步骤,以蛋白质自切割元件内含肽（Intein）替代蛋白酶,并以细菌自身产生的聚β-羟基丁酸酯（PHB）颗粒替代亲和配基,构建了新型内含肽介导PHB纯化PoIFNα的体系.结果显示,构建的基因工程大肠杆菌系统可成功实现PoIFNα的表达和纯化;φ（乳酸钠）=2.7%时,比较适宜工程菌的PHB累积;当诱导自切割反应温度为20℃,pH=6.5,反应时间为24~36 h时,可以实现内含肽C端高效自切割,纯化出的PoIFNα产量为20~30 mg/L.实验为重组猪α干扰素的工业化规模生产奠定了基础.     

Reconstruction of enzymatic activity from split genes encoding glyphosate-tolerant EPSPS protein of Psedomonas fluorescens G2 strain by intein mediated protein complementation

N-phosphonomethylglycine, commonly referred to as glyphosate, is a broad-spectrum, non-selective herbicide used for the control of weeds in glyphosate-to- lerant crops. Glyphosate inhibits the 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), a key en…     

Spliced leader RNAs from lower eukaryotes are trans-spliced in mammalian cells.

Exon sequences present on separate RNA molecules can be joined by trans-splicing in trypanosomatids, Euglena, and in the nematode and trematode worms. Trans-splicing involves an interaction between a 5' splice site present in a spliced leader RNA and a 3' splice site located near the 5' end of pre-messenger RNAs. In vitro trans-splicing of artificial mammalian pre-mRNAs has been reported, but the efficiency of splicing appears to depend on sequence complementarity between the two substrates. There has been speculation that some natural pre-mRNAs can be trans-spliced in mammalian cells in vivo, but alternative interpretations have not been ruled out. Here we show that spliced leader RNAs can be accurately trans-spliced in mammalian cells in vivo and in vitro. Both nematode and mammalian 3' splice sites can function as acceptors for trans-splicing in vivo. These results reveal functional conservation in the splicing machinery between lower eukaryotes and mammals, and they directly demonstrate the potential for trans-splicing in mammalian cells.     

插电式并联混合动力汽车再生制动控制策略

再生制动是混合动力汽车区别于传统汽车的技术特点,是提高车辆燃油经济性的重要措施之一.以一种轴间力矩耦合的插电式并联混合动力汽车为研究对象,从再生制动分配算法的影响因素入手,提出了一种带有模糊控制的混合动力汽车再生制动能量管理策略.所设计的控制策略主要针对两个层面的控制决策,顶层是轴间制动力矩的分配决策,底层是再生制动电机所在的后轴力矩在摩擦制动与再生制动之间的分配决策.采用多种典型车辆行驶工况对所提出的模糊控制策略进行仿真研究.结果表明,所提出的模糊控制策略能够明显改善车辆的能量回收效果,与传统理想制动力分配曲线控制策略相比,能量回收最多可提高23.44%.     

东方红—802拖拉机开口前梁的有限元分析

本文利用有限单元法对东方红—802拖拉机前梁改型后的应力分布和安全可靠性作了详细分析,进一步论证了改进方案的可行性。     

Stable expression of the bacterial neor gene in Leishmania enriettii

Molecular genetic studies in parasitic protozoa have been hindered by the lack of methods for the introduction and expression of modified or foreign genes in these organisms. Two recent reports described the transient expression of the bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene under the control of parasite-specific sequences. We now describe the stable expression of a selectable marker, the gene for neomycin resistance (neor) in Leishmania enriettii. A chimaeric gene containing the neor gene inserted between two alpha-tubulin intergenic sequences was introduced into the cells and drug-resistant L. enriettii were observed which stably expressed the neor gene. One goal of this work was to analyse the sequences necessary for trans-splicing of messenger RNA, as trypanosomatids have a novel process of RNA trans-splicing, described initially in Trypanosome brucei and subsequently in several other trypanosomatids, including L. enriettii. Many trypanosomatid genes are arranged in tandem arrays and the intergenic sequences contain both the splice acceptor site for the addition of the spliced leader sequence and a putative polyadenylation site. Messenger RNA isolated from several different neor L. enrietti lines contained the spliced leader sequence joined to the neor gene at the position of the splice acceptor site in the alpha-tubulin intergenic sequence. The neor mRNA was also polyadenylated. Plasmid DNA is present within the drug-resistant organisms and appears to be extrachromosomal. The development of these methods allows the functional analysis of sequences necessary for trans-splicing.