人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和生物学活性研究

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢,具有重要的生理功能。为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1基因5’端含有1～534核苷酸的cDNA序列一PIFAC。在PIF△C的5’端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体,得到重组质粒pET15-PIF△C。以此重组质粒转化Rosetta TM2（DE3）感受态细胞,使PIFAC蛋白质在大肠杆菌中得到表达。在4℃通过快速液相色谱纯化系统,通过一系列色谱层析柱纯化了PIFAC蛋白质。以纯化的PIFAC蛋白质免疫家兔制备了抗血清,并检测了纯化的PIFAC的生物化学活性。结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端,具有使单链DNA复性的特性。PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性,暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复,包括断裂的双链DNA的修复。     

长片断引物反向PCR方法构建重复序列的重组质粒

构建重复序列的重组质粒比较困难,因为扩增重复序列会产生多聚物.利用长片断引物反向PCR方法构建重组质粒pET20b-C1-Xyn-C1,将碳水化合物结合模块C1连接在木聚糖酶Xyn两端,为类似质粒的构建提供新方法.第一步,以C1特异性正向引物LF、载体特异性反向引物VRP从pET20b-Xyn-C1模板上扩增C1-pET20b长片断DNA,作为第二步的正向引物;第二步,以pET20b-C1-Xyn为模板,Xyn特异性反向引物RX,正向引物与模板上pET20b同源区域匹配,阻止了模板上C1同源区域的匹配,从而抑制多聚物产生;反向PCR扩增得到线性重组质粒C1-pET20b-C1-Xyn,将此线性产物用T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,得到含重复序列的pET20bC1-Xyn-C1转化子.     

降钙素受体药物靶点区域的表达、复性及鉴定

本实验截取了人降钙素受体N端胞外结构域涉及药物靶点的第20~160位氨基酸残基区域对应的编码序列,根据大肠杆菌偏爱密码子优化后,人工合成相应的基因,运用分子克隆技术将所合成的基因克隆到pET22b(+)载体,重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达.结果表明,Nt-CTR蛋白质以包涵体形式表达,所得包涵体蛋白质通过高效的复性方法,最终得到了大量纯化的可溶性Nt-CTR蛋白质.融合蛋白质通过Western-Blot鉴定表达正确.本研究为CTR的结构研究和CTR相关疾病的药物筛选提供了基础.     

复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12～127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5％的α-螺旋,30％的β-折叠和65％的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性（英文）

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12~127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5%的α-螺旋,30%的β-折叠和65%的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

重组羧肽酶B在胰岛素原C肽制备工艺中的应用

用RT-PCR方法克隆了大鼠羧肽酶原B的cDNA编码序列,将其重组到原核表达质粒pT7-473中,并在大肠杆菌中以包涵体方式获得高表达。SDS-PAGE电泳及灰度扫描显示表达量达菌体总蛋白的35％,表达产物融合了表达质粒上的6His。在变性条件下,经Ni-NTA柱纯化,得到羧肽酶原B,在复性液中进行稀释复性后,胰蛋白酶切得具酶活性的羧肽酶B,然后经DEAE-FF分离纯化获得较纯的羧肽酶B(28．5mg／L),比活为13．5u／mg。用RP-HPLC分析胰蛋白酶 羧肽酶B酶解胰岛素原C肽三聚体的酶解产物,证明该重组的羧肽酶B可替代提取的羧肽酶B应用于胰岛素原C肽的制备工艺中。     

ERF类转录因子OPBP1基因重组质粒的构建及蛋白质表达

探讨了OPBP1基因的蛋白质表达方法.利用DNA重组技术,将pGEM-OPBP1和pET-32a分别进行SalⅠ和NotⅠ双酶切,连接,获得了重组质粒pET-OPBPI质粒.IPTG诱导其蛋白质表达.获得了高表达量的OPBP1融合蛋白.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

参与碱基切除修复的AP内切酶1的克隆和蛋白质纯化

碱基切除修复途径是去除氧化和甲基化碱基的最主要途径。在碱基切除修复过程中,多个蛋白质,诸如DNA糖基酶、APE1内切酶、DNA聚合酶beta和DNA连接酶在体内的精密调节下高度协调地作用,从而切除受损碱基,使DNA恢复正常序列。碱基切除修复对维持基因组的稳定及抑制肿瘤发生等生理过程有重要作用。为了进一步从分子水平阐明APE1的作用机制,我们从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到APE1基因,使APE1在大肠杆菌中得到表达,并用蛋白质纯化的快速液相层析法经过一系列层析柱纯化了重组APE1蛋白质,APE1的生物化学功能研究正在进行中。     

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV—Ch)RNA2为模板，利用人工合成的特异性引物，进行反转录及PCR扩增，分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1．32kb和3′端及其非编码区的1．23kb cDNA序列．用限制性内切酶切割PCR产物后，与pUCl9重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒，用限制性内切酶分析及PCR鉴定，得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒。已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒．进行了全序列测定，并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较，其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97．8％，推测的氨基酸序列的同源性达97．6％，3′端非编码区核苷酸序列同源性为98．2％．并将全长复制酶基因与植物表达载体pROKⅡ重组，得植物转化载体pAlMV—FL．