一个简便、经济的转化胰岛素基因表达产物为重组胰岛素的方法及其应用

建立了直接用胰蛋白酶酶解重组胰岛素基因表达产物的方法,并用以加工猪胰岛素前体(PIP),[B16Ala]PIP和[B26Ala]PIP,分别获得保留了各自亲本全部生物活力的(去B30)胰岛素、(去B30)[B16Ala]胰岛素和(去B30)[B26Ala]胰岛素.进一步证明胰岛素的B链C末端残基不是胰岛素生物活力所必需的.该方法比转肽方法简便、产品得率高、避免了使用有机溶剂;比胰蛋白酶/羧肽酶方法,省去了羧肽酶制剂的使用.(去B30)[B16Ala]胰岛素和(去B30)[B26Ala]胰岛素还保留了其亲本的无自身聚合能力的性质,是单体胰岛素,在临床应用中可代替原单体胰岛素,[B16Ala]胰岛素和[B26Ala]胰岛素.     

人胰蛋白酶原-2在大肠杆菌中的表达、纯化与活性测定

胰蛋白酶原-2是急性胰腺炎相关的敏感而特异的标志物,并且与多种肿瘤转移的过程密切相关．对胰蛋白酶原-2基因5’端4个氨基酸的密码子碱基进行简并突变,并在其3’端连接6个组氨酸编码序列构建含重组质粒pBVTg2的大肠杆菌工程菌-pBvTg2／DH5α．重组大肠杆菌经温度诱导后获得了高效表达,重组蛋白占总菌体蛋白的20％,并以包涵体形式存在．包涵体经尿素缓冲液裂解后,通过Ni-NTA亲和树脂一步分离纯化．纯化蛋白经SDS-PAGE分析及利用anti—histidine mAb进行Western blotting分析,以及蛋白N末端测序分析,结果表明与目的蛋白特征相符合．纯化的重组人胰蛋白酶原-2经复性后能与天然人胰蛋白酶原-2的单抗antihTrypsinogen2 mAb特异结合,复性后的蛋白在肠激酶作用后测得具有74BAEEU／mg的胰蛋白酶比活力,为进行胰蛋白酶原-2单克隆抗体的制备及其检测和应用奠定了基础．     

重组人胰岛素的体外复性纯化

对大肠杆菌表达的重组人胰岛素原包涵体蛋白的变性复性条件进行了优化。考察了变性液中DTT的浓度,复性液的pH值,还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的物质的量比,甘氨酸(Gly)浓度对复性的影响。结果表明,在变性液中加入60mmol/L DTT,复性液pH9.5,GSH与GSSG物质的量比为5∶1,Gly浓度为50mmol/L条件下复性率最高。复性后的重组人胰岛素原过DEAE-Sepharose FF柱,经过TPCK-胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后,再过Sephadex G-25柱,得到纯度较高的重组人胰岛素。目的蛋白收率为96mg/g干菌体。     

重组人胰岛素及C肽的分离纯化

对基因工程构建的含重组人胰岛素和C肽基因的毕赤酵母工程菌进行诱导表达，工程菌用甲醇诱导72 h后，离心去除菌体，上清液经中空纤维膜超滤后SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析，0~400 mmol/L NaCl梯度洗脱，得到纯度大于92％的重组人胰岛素原。经Lys-C酶和羧肽酶B酶切后，Sephadex G-25柱分离，得到了重组人胰岛素和C肽。     

B甸羧端去三肽（B28—B30）与去四肽（B27—B30）胰岛素的制备及去三肽 …

双突变的胰岛素原基因在Ｅ．ｃｏｌｉ温度诱导表达体系中直接高密度发酵表达，表达产物形成的包含体经变复性处理及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０纯化后，再由胰酶及羧肽酶Ｂ联合酶切，ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑ纯化，最终得到Ｂ链羧端去三肽胰岛素（Ｂ２８－Ｂ３０）（ＤＴＲＩ）和去四肽（Ｂ２７－Ｂ３０）（ＤＴＩ）胰岛素的纯品。应用悬滴气相扩散法在含丙酮的柠檬酸钠缓冲体系中培养出可供Ｘ射线衍射用ＤＴＲＩ单晶，空间群为Ｐ２１２     

6个氨基酸小C肽人胰岛素原类似物基因的构建和表达

用片段置换法，从在Ｃ肽两端具有酶切位点的双突人胰岛素原因中，将Ｃ肽基因替换成含Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ６个氨基酸小Ｃ肽基因。将这个小Ｃ肽岛素原类似物基因重组到具有Ｔａｃ启动子的质粒中，并与部分牛凝乳酶原基因融合，在Ｅ．ｃｏｌｉ中得到了高效表达。表达的ＢＣ＇Ａ融合蛋白占菌体总蛋白的１６％。表达产物以包含体形式存在，经ＣＮＢｒ裂解及磺酸，再经复性后，具有对胰岛素的放射免疫活性。     

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子,采用基因半合成技术合成人胰岛素基因.将合成的胰岛素基因克隆到pP IK 9质粒,构建了毕赤(P ich ia)酵母重组表达载体pP IN S319,用B g lⅡ线性化后用电转化法导入毕赤酵母G S ll5菌株,经过营养筛选和PCR复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株.经SDS-PAGR和密度扫描分析表明,合成的人胰岛素基因能够在毕赤酵母中高效分泌性表达,表达量可达0.563 m g/mL,表达产物无需转肽过程,只经过胰蛋白酶和羧肽酶B简单处理即得到优质重组人胰岛素,其体内活力约为30 IU/m g.     

重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和鉴定

用PCR将化学合成的人胸腺肽α1基因扩增并克隆到pMD18-T载体中,经过KpnI／SacI酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体pET32b中硫氧还蛋白下游．将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Zn—Sepharose亲和层析纯化以及复性处理,从每升菌液中可获得35mg硫氧还蛋白-胸腺肽α1融合蛋白．经凝血因子Xa酶切、Zn—Sepharose亲和层析以及反相高效液相色谱纯化获得3．8mg重组人胸腺肽．小鼠胸腺细胞凋亡实验表明,重组人胸腺肽能显地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡,且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系．     

人胰岛素原类似物（B-Arg-Arg-A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（PCR）法将C肽为6个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成C肽仅为2个精氨酸残基的胰岛素原类似物（BArg-Arg-A）基因,即把pUC18BC'A改建为pUC18BR₂A。再将pUC18BR₂A与pJG105重组为表达质粒pJG107,使B-Arg-Arg-A与pJG105编码的一种多肽构成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的58%。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶（Lys-C）成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签，将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a；其次以IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达，并针对重组菌株JM109DE3＿PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C；再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液，通过Sephadex G25层析脱除DTT（二硫苏糖醇），并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠；进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤，获得高纯度的重组Lys-C；最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测，分析重组Lys-C的活性水平。结果表明：重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L，经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L；添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性，复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍，最高可达到13.8 U/L；经过多步纯化后，重组Lys-C的...     

中国主要地区电子商务发展特点分析

通过分析中国主要地区电子商务企业的数量、交易额和市场占有率,总结出这些地区电子商务发展的基本特点.研究发现,北京、浙江B2C电子商务企业发展领先全国;浙江在B2B电子商务方面占有绝对优势,而广东企业应用电子商务较为普及和成熟.     

B-凸包的内部结构

利用Bector等人[1、2]引进的B-凸集定义,给出了B-凸包定义,并研究了B-凸包的内部结构。     

B282C电子商务环境下供应链收益分配机制研究

通过对2009年李宁公司网络渠道外包的个案分析，研究了B282C电子商务环境下制造商、代客服务商渠道收益分配问题，得出最优收益分配机制。比较分析发现电子商务平台积分回馈的提高，将有助于系统利润的增加。     

电子商务时代的B2B与B2C商务模式探索与研究

电子商务的发展前景十分诱人,它是随着信息技术的完善所带来的全新商务模式。如何了解全新的商务模式的运作,更好的了解以B2B或B2C为代表的商务模式的发展潜力？本文从B2B与B2C的定义入手,通过分析其运作过程,展望了两个模式的发展前景。     

B2B电子商务与企业供应链管理

供应链管理与电子商务是近年来人们关注的问题,本文介绍了电子商务与企业供应链管理的关系。     

B2B企业信用评估模型的研究

分析了当前B2B企业信用评估方法上存在的问题,以网下认证与网上评估相结合的原则,建立了企业信用评估指标体系,构建了企业信用评估模型,为B2B企业进行全面、有效的信用评估提供较为科学的方法.     

网络营销导向下的中小企业B2B网站优化分析

网络营销导向下的网站优化是一项非常重要的基础性网站推广上作。中小企业要想取得竞争优势，就必须强化其品牌形象、提高其服务质量，通过针对性的网站优化以网络营销导向、用户为目标，建立专业化网站，进行个性化的网络营销，将为更多的互联网用户所欢迎，让网站内容为用户提供有价值信息的同时，也为网站自身的推广发挥作用。     

电子商务的优势与劣势

介绍了电子商务的概念及电子商务的分类,阐述了电子商务的优势和劣势。     

B细化处理对亚共晶铝硅合金力学性能和断口形貌的影响

采用金相显微镜、扫描电镜、电子拉伸试验机等检测手段对B细化处理后的亚共晶铝硅合金显微组织、断口形貌和力学性能进行了研究.结果表明,经B细化处理后,a-Al相枝晶被细化,致使铝硅合金力学性能得到明显改善.其中,B含量为0.036Wt%时,合金组织最理想,其σb、δ比未细化时分别提高了15.2%和67.8%.从断口形貌上看,试样断口形貌均呈现准解理断裂.其中,B含量为0.036wt%时的试样断口韧寄较为深而小,呈现较好的强韧性.     

B2B电子商务的实现技术的研究

B2B电子商务能为企业带来很大的效益.本文介绍了B2B电子商务的几种常见的实现技术:B/S结构的开发技术、EDI技术、Web服务技术,并对这几种常见的实现模式进行了比较.分析了基于J2EE的三层B/S结构以及在构建B2B电子商务平台的过程中用到的几种关键的J2EE技术.