毛霉Amylomyces.rouxii HN0512中内切葡聚糖酶的诱导、纯化及性质分析

Amylomyces.rouxii HN0512经羧甲基纤维素钠(CMC-Na)诱导,可产内切葡聚糖酶,通过正交试验优化诱导培养基,结果在培养基为1％羧甲基纤维素钠、2％麸皮汁、0.2％蛋白胨(以上均为质量分数)时可以诱导出较高活性的酶,用HiTrap QFF阴离子交换层析从培养液上清中纯化得到了具有内切葡聚糖酶活性的P3组分,活性组份的SDS-PAGE分析电泳呈现一条带,经AlphaEaseFCTM软件预测P3的分子质量为18.7 ku;酶反应的最适温度和pH分别为60℃和5.0,在pH 4.0 -7.0范围内稳定性最好,在70℃还能保持50％以上的酶活力;金属离子Fe3+、Ba2+、Fe2和表面活性剂尿素对酶起到了激活作用;反应动力学参数Km和Vmax分别为11.68 mg· mL-1、0.56 μmol·L-1·min-1.本研究获得了一株产内切葡聚糖酶新菌种,并为进一步用基因工程方法克隆并构建重组内切葡聚糖酶基因工程菌奠定了重要的基础.     

芽孢杆菌WF63脂肪酶分离纯化及酶学性质

芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、Sephaery1 S200柱层析、CMSephrose FF柱层析,得到纯化的脂肪酶,纯化倍数为9.45倍,活性回收率为4.27%.对该酶性质研究表明:该酶水解橄榄油的最适温度为50℃,最适pH为8.0,在60℃以下和pH4~10之间有很好的稳定性.K+,Mg2+对该脂肪酶的水解活性有促进作用,而Na+,Mn2+,Ca2+对脂肪酶则没有显著的促进作用,Fe2+对酶活的抑制作用不明显.浓度为0.1%时,Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用;Brij 35,Tween-80对酶活力的影响不明显;离子型表面活性剂SDS则表现出抑制作用.     

一株脂肪酶的筛选和产酶条件及其酶性质的研究

从东营油污样中分离获得一株产脂肪酶的菌株BYCM-1,经鉴定为根霉属.研究了该菌株的产酶条件及其酶性质.研究表明该酶最适的产酶条件为:培养基初始pH 6.5,温度40℃,培养时间72 h.酶作用的最适pH值为8.0,最适温度为40℃.Ca2 和K 对酶活性有一定的激活作用,而Mg2 ,Cu2 ,Fe2 对酶活性有不同程度的抑制作用.     

参环毛蚓肠道内源性纤维素酶的分离纯化及酶学性质分析

通过对参环毛蚓肠道组织提取液进行DEAE阴离子交换及凝胶过滤层析,获得参环毛蚓单一的内源纤维素酶的活性组分.根据AlpHaEaseFCTM软件计算出该组分分子质量约为45 ku,命名为Cx1.羧甲基纤维素钠(so-dium carboxymethylcellulose,CMC)法对Cx1进行酶学性质分析.分析结果显示:对于底物羧甲基纤维素钠,Cx1的米氏常数(Km)为0.289 mg/mL,Vmax为0.446 U.mL-1.min-1,反应最适温度为55℃,最适pH为6.0,在40~60℃、pH5.0~8.0具有较好的热稳定性和pH稳定性,其相对酶活力都能保持在55%以上.Ag+和Ba2+对Cx1起显著激活作用,K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、NH4+、Ni2+、Na+、Pb2+部分抑制酶活性,Cu2+离子对Cx1有完全抑制作用,而Fe2+对酶活力无明显影响.     

青藏高原土壤产淀粉酶菌株的分离、鉴定及产酶特性研究

从青藏高原农田采集的13份土样中筛选到10株产淀粉酶活力较高菌株,其中菌株ZF-3产酶活性最高,该菌株采自定日县海拔4400 m左右处.通过菌落形态、生理生化特性和16S r RNA序列比对,鉴定该菌株为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus).对其粗酶液酶学性质研究表明,酶反应最适温度为60℃,最适作用p H值6.0,Ca2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+等多种金属离子对酶活有明显的激活作用,Mg2+对酶活有抑制作用.     

粘质沙雷氏菌脂肪酶的分离纯化

粘质沙雷氏菌L-42发酵液经离心、丙酮沉淀、离子交换层析以及凝胶过滤等步骤,获得了比活性为1166.61 U/mg 的碱性脂肪酶,提取得率为20%,纯化倍数45.57倍,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上均呈现单一蛋白质条带,显示该酶为单体,SDS-PAGE测得酶的相对分子量约为 50 kDa.酶学特性研究结果表明,该酶的最适反应温度为35 ℃,最适pH值为9.0,在50 ℃以下、pH6.0~10.0范围内保持较好的稳定性. Ca2+、Mg2+ K+、Mn2+、Ni+等对酶有激活作用,而Fe2+、Zn2+、Co2+等对酶活有抑制作用.     

蛹虫草纤溶酶酶学性质的初步研究

对蛹虫草纤溶酶的酶学性质进行了研究,结果表明,其纤溶活性随温度(≤45℃)的升高和保温时间的延长,逐渐下降,当温度超过50℃时,则随温度的升高和保温时间的延长急剧下降;蛹虫草纤溶酶的最适pH为7.0,在碱性条件下纤溶活性相对稳定;金属离子Ca2+和Fe2+对蛹虫草纤溶酶的活性有显著激活作用;抑制剂中PMSF对蛹虫草纤溶酶活性的抑制作用较小,而Aprotinin、EDAT和EGTA对其纤溶活性均有较显著的抑制作用,说明蛹虫草纤溶酶可能不同于之前报道的纳豆激酶(丝氨酸蛋白酶),而是一种全新的蛋白酶,但对这一点还需要进一步的研究验证.     

水蛭的酶解及其产物抗凝血活性评价

以水蛭为原料,研究不同酶解因素(酶种类、酶用量、酶解时间、pH值、酶解温度、底物浓度)对水蛭酶解产物抗凝血活性的影响规律,优化水蛭的酶解技术参数,并对酶解产物进行活性评价;研究结果表明,优化后的酶解技术条件为,适宜的水解酶为胰蛋白酶,酶用量7000 U/g,酶解时间7 h,酶解pH 8.3,酶解温度50℃,底物浓度14%(w/w)。在该条件下得到的酶解产物抗凝血酶活性最高,达到640 U/g。     

漆酶/脂肪酶催化制备丝裂霉素类似物及其响应面法优化

丝裂霉素及其类似物,广泛应用于各种肿瘤.为了获得优异的产率和环境友好性,采用一锅法工艺,以漆酶/脂肪酶为催化剂,催化2-甲基苯-1,4-二酚与正丁胺的多米诺反应制备丝裂霉素类似物2-丁胺-3-甲基-1,4-苯醌(c).采用响应面技术优化了反应条件:2-甲基苯-1,4-二酚与胺的物质的量比为1.16∶1、漆酶与脂肪酶的活性比为1.14∶2、反应温度为38.9 ℃,最佳产率达到87.17%.建立了产率模型,该模型考虑了2-甲基苯-1,4-二酚与胺的物质的量比、漆酶与脂肪酶活性比和反应温度对产率的影响,可以准确的预测产率(R²为0.994 1).漆酶/脂肪酶协同催化体系一锅法合成丝裂霉素类似物,显著提高了产率,可作为提高丝裂霉素类似物产率的绿色替代工艺.     

产普鲁兰酶克雷伯氏菌的分离鉴定及酶学性质研究

利用曲里苯蓝法从淀粉加工厂废水氧化池酸性污泥样品中筛选普鲁兰酶产生菌,对筛选到的GXAS-38菌株进行形态观察、生理生化特征分析、16SrDNA序列系统发育分析和普鲁兰酶酶学性质研究,并用PCR方法克隆GXAS-38菌株的普鲁兰酶基因。结果表明,GXAS-38菌株属于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),其产普鲁兰酶的最适反应温度为60℃,在温度35～50℃时酶活较稳定;最适反应pH值5.5,在pH值5.0～7.5时酶活较稳定。Ca2+、Na+和Li+对GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性有激活作用;Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+和Ba2+对GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性有抑制作用;螯合剂EDTA能够强烈地抑制GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性,GXAS-38菌株的普鲁兰酶反应需要金属离子参与。GXAS-38菌株完整的普鲁兰酶编码基因全长3291bp,编码1096个氨基酸。     

假单胞交替菌BYS-2产褐藻胶裂解酶条件研究

以褐藻酸钠作为初筛培养基的唯一碳源,从鲍鱼养殖水样中分离获得一株产褐藻胶裂解酶的假单胞交替菌BYS-2。对该菌株进行产酶条件研究,获得最适产酶配方(w/v)为：褐藻酸钠0.1%,葡萄糖0.05%,酵母膏1%,黄豆饼粉0.3%,(NH4)2HPO4 0.3%,初始培养基pH8.0;最佳产酶条件为：接种量2%(v/v),装液量50mL/250mL,发酵温度20℃,摇床转速200 r/min,在此条件下发酵24h酶活力可达5.29U/mL,比优化前(1.57 U/mL)提高2.37倍。     

高温解烃菌NG80-2黄素还原酶基因的克隆、表达及其酶学性质研究

对1株高温解烃菌NG80-2黄素还原酶基因,nfr进行了克隆,并在E.coli BL21中实现高效表达.对纯化的Nfr酶学性质进行研究,发现Nfr可以利用NADH、NADPH、FMN、FAD分别作为供氢体和氢受体,其中NADPH和FMN为最适底物.Nfr的最适反应温度为60～70℃,最适反应pH为5.0.在耐受性试验中,此酶在65℃高温中保温30 min后可保持47.3%的相对酶活.在受试的金属离子中,Fe2+对酶活性的抑制作用最大.     

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

库拉索芦荟叶皮经匀浆、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose fast flow层析和Superdex-200prep grade层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,BGL).纯化结果是β-葡萄糖苷酶比活力为98.48U/mg,纯化倍数为328.27倍,酶活性回收率为9.87%,全酶分子质量约为69.3kD,亚基分子质量约为69.7kD.酶学性质研究表明:β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和5.0;在20~30℃及pH4.0~8.0范围内稳定性较好;最适条件下,以pNPG为底物的K_m值为2.21mmol/L,V_(max)为1.381μmol/(min·L).乙醇,抗坏血酸,Mn~(2+),K~+对该酶活性具有激活作用;SDS,Cu~(2+)对该酶活性具有强烈抑制作用;异丙醇,EDTA,尿素,Mg~(2+),Li+对该酶活性影响较小;甲醇对该酶有双重作用.     

阴沟杆菌属产脂肪酶菌株的酶学特性脂肪酶提取与固定

从油污土壤中培养筛选到一株产脂肪酶菌株,利用形态学和分子生物学法鉴定该菌(Enterobactersp.).探讨了温度、酸度及培养时间等生态因子对菌株产酶活性的影响.结果表明pH8.5条件下能够获得较高酶活,5d培养周期内脂肪酶活性随培养时间的增加而增加.采用空抽滤联合法实现脂肪酶的提取与固定,固定化酶能够保持游离酶活性的50%左右.     

变形杆菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的展示表达及重组酶的特性

在生物转化处理工业中利用细胞表面展示技术表达脂肪酶作为一种全细胞催化形式具有很大优势,因为脂肪酶展示在细胞表面作为一种固定化酶.以超折叠绿色荧光蛋白的羧基端结构域作为锚定区,构建变形杆菌来源的脂肪酶与羧基端结构域的融合基因.将融合基因插入到p ETsf GFP表达载体中,得到表面展示载体p ETsf GFP-Lip A.将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-Blue宿主菌中经自诱导后,利用免疫荧光显微技术和流式细胞仪分析确定脂肪酶成功展示于大肠杆菌细胞表面.重组酶的最高酶活达到7 009 U/g干细胞,最适反应温度和p H分别为为37℃和8.0,表面活性剂Tirton X-100、Co~(2+)和Ni~(2+)能显著提高脂肪酶的酶活,60%丙酮处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为104%,60%乙醇处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为117%,表明脂肪酶对有机试剂具有很好的耐受性.以上实验结果表明:细胞表面展示技术表达脂肪酶的最大优点为工业化应用提供了坚实的基础.     

一株产耐高温漆酶真菌的筛选

从安徽省合肥市西郊的大蜀山上采集了40余株木腐真菌,将其在含有α-萘酚的麸皮汁平板上分离纯化后,根据菌落周围产生紫色氧化圈的显著程度筛选出4株漆酶活性较高的菌株,将这4株真菌进行摇瓶培养,测定并比较它们所产漆酶的活性,得到一株产酶活力最高的菌株SY04.菌株SY04在液体培养3d后粗酶液漆酶活力为330U/mL,在对其漆酶粗酶液进行活性分析后发现,该菌所产漆酶在60℃下保温30min后,活性不受明显影响,其最适反应温度为60℃.该菌所产漆酶具有较高的最适反应温度和热稳定性,具有一定的研究和应用价值.     

包衣酶在油/水两相体系中催化水解橄榄油反应

用合成的谷氨酸十二烷基酯核糖醇对来源于Candidarugosa的脂肪酶包衣后在油/水两相体系中水解橄榄油为反应模型.确定了最佳水油比范围为1～3,最适pH值为7.0左右,温度为30℃,油相有机溶剂为异辛烷.包衣酶的最大活性达到48.8mmol·min-1·g-1蛋白质,是天然酶活性的1.8倍.对底物选择性研究表明:包衣酶和天然酶的最适底物均为橄榄油,酰基链越长,酶活越高.包衣酶的米氏常数只有天然酶的一半,最大反应速度是天然酶的1.4倍.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticalipase B,CALB)的表达量,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子(10 mmol/L)Ca2+,Zn2+,Mn2+有助于CALB酶活力的提高,而Cu2+,Ag+,Fe3+强烈抑制酶催化反应.     

2 3-二羟基联苯酶促降解及编码酶基因扩增

一株新分离的联苯降解菌Dyella ginsengisoliLA-4的细胞粗提物可以降解邻苯二酚类化合物生成间位开环产物.实验证明菌株LA-4中的2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶(BphC)为组成酶.以2,3-二羟基联苯、邻苯二酚和4-氯邻苯二酚为底物时,酶的比活分别是7.37、0.2和0.06 U/mg.考察了金属离子及抑制剂对酶活性的影响.金属离子对酶活性影响的结果表明Fe2+能促进粗酶对邻苯二酚和4-氯邻苯二酚的降解,但对2,3-二羟基联苯却起到抑制作用.当氧化性抑制剂H2O2的浓度大于1 mmol/L时酶活完全丧失,说明其属于Fe(Ⅱ)依赖型外二醇双加氧酶类.通过PCR方法扩增出菌株LA-4中bphC基因的保守区,其序列与已知bphC基因相似性约为73%.