参环毛蚓肠道内源性纤维素酶的分离纯化及酶学性质分析

通过对参环毛蚓肠道组织提取液进行DEAE阴离子交换及凝胶过滤层析,获得参环毛蚓单一的内源纤维素酶的活性组分.根据AlpHaEaseFCTM软件计算出该组分分子质量约为45 ku,命名为Cx1.羧甲基纤维素钠(so-dium carboxymethylcellulose,CMC)法对Cx1进行酶学性质分析.分析结果显示:对于底物羧甲基纤维素钠,Cx1的米氏常数(Km)为0.289 mg/mL,Vmax为0.446 U.mL-1.min-1,反应最适温度为55℃,最适pH为6.0,在40~60℃、pH5.0~8.0具有较好的热稳定性和pH稳定性,其相对酶活力都能保持在55%以上.Ag+和Ba2+对Cx1起显著激活作用,K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、NH4+、Ni2+、Na+、Pb2+部分抑制酶活性,Cu2+离子对Cx1有完全抑制作用,而Fe2+对酶活力无明显影响.     

耐硫甲烷化催化剂的成型工艺探究

采用挤出法对Ce O2-Al_2O_3载体和MoO_3/ZrO_2催化剂进行了成型处理并研究了成型工艺对高温、低温催化剂耐硫甲烷化性能的影响,考察了不同成型助剂对负载型Mo基催化剂成型效果和耐硫甲烷化活性的影响,并对所制备的成型催化剂进行稳定性考察.结果表明,铈铝复合载体的适宜成型条件是水粉质量比约0.45~0.55、黏合剂为10%,(质量分数,下同)的拟薄水铝石,胶溶剂为10%,的硝酸,润滑剂为1%,的田菁粉;MoO_3/ZrO_2低温催化剂的成型工艺条件是拟薄水铝石添加量为10%,,硝酸添加量为5%,,田菁粉添加量为1%,.在此条件下制备的高温和低温成型催化剂均具有良好的稳定性,这为耐硫甲烷化催化剂的工业放大研制提供了重要依据.     

一种线路断路器失灵保护新方案

经复合电压闭锁的线路断路器失灵保护在长线路末端故障时,存在因电压闭锁元件定值灵敏度不足而拒动的问题.首先分析了传统基于复压闭锁的失灵保护判据拒动的情形,然后提出了基于站域信息共享的线路断路器失灵保护新方案:在站控层计算保护判据生成保护出口动作信号,采用冗余电流信息对有流/无流进行检测,判断断路器是否断开,并使用重合闸检无压信号对复压闭锁判据进行补充.理论分析和仿真结果表明,基于站域信息共享的失灵保护新方案具有较高的可靠性.     

Armillariella tabescens发酵生产菌丝体复合多糖的条件

试验研究了5 L发酵罐上液体深层培养假密环菌,生产菌丝体复合多糖的发酵条件,同时比较用酵母泥作培养基和用马铃薯作培养基发酵过程中假密环菌的生长情况、产多糖量和菌丝体生长形态.结果表明:接种量为5%,温度(26.0±0.5)℃,pH为6.00±0.2,溶氧保持在20%以上;从培养开始到收罐的0~85 h,搅拌速度从80 r/m in到160 r/m in分阶段递增;补料分批发酵,上罐培养3~4 d为最适发酵条件.使用马铃薯复合培养基发酵的发酵液中菌密度最高可达11.541 g(干质量).L-1,而使用酵母泥复合培养基菌密度最高达9.657 g(干质量).L-1,前者比后者高出19.51%.而酵母泥培养基的多糖质量浓度则最高达1.27 g.L-1,比马铃薯培养基高出22.83%.且平均培养时间比马铃薯培养基缩短12 h.     

瑞士“绿色山地经济模式”对贵州的启示

瑞士地处欧洲内陆,历史上是个资源贫瘠较为落后的农牧业国家。在自然地理条件与产业发展条件上,现阶段的贵州和历史上的瑞士有着很大的相似性,从自然地理特征和第一、二、三产产业发展条件来看,瑞士和贵州在发展第一、二产业上有一定劣势,在发展第三产业上略有优势,“后发赶超”一直是二者经济社会发展的主题。瑞士“绿色山地经济模式”的成功经验是：准确选择主导产业,积极构筑中小企业的产业集群,注重科技创新与人力资源开发,坚持生态环境与经济发展的综合平衡。“绿色赶超”是瑞士克服地理区位、资源禀赋等经济发展劣势,发展成为世界上环境最优美、生活最富裕国家的重要路径;瑞士模式对贵州“绿色赶超”有着重大而深刻的启示。     

用有机相提高共价固定化胰蛋白酶活力

蛋白质共价固定时,容易发生由于共价化学反应而引起蛋白质构象的不可逆变化而造成蛋白活性丧失的现象,该问题在诸如药物修饰、蛋白质芯片、酶生物电极等制备中十分重要.本研究以壳聚糖为载体,以胰蛋白酶为研究对象,比较了水相与多种有机相条件下的共价固定化酶的动力学特性.结果发现,固定化酶特征常数Km值:所有的有机相条件下共价固定的胰蛋白酶均优于传统的水相中共价固定的该酶,且更接近于游离酶的Km值(水相中固定的胰蛋白酶其Km是1,4-二氧六环中固定的胰蛋白酶的3.69倍),提示有机相中固定的胰蛋白酶比水相中固定的该酶更接近于酶的天然构象;与水相中共价固定的胰蛋白酶相比,所有有机相中共价固定的胰蛋白酶均获得了更高的转换数Kcat(乙酸乙酯中固定的胰蛋白酶其转换数Kcat是水相中固定的该酶的58.64倍),即有机相中共价固定的胰蛋白酶均显示出比传统的水相中共价固定的该酶更高的催化效率.本研究表明,利用酶蛋白在有机相中变得刚硬的特性,在有机相中对某些酶进行共价固定化修饰有利于维持酶蛋白天然构象,一定程度上能够克服传统水相中进行共价固定化过程中造成的酶变性失活现象.     

以病毒的230 kb DNA分子为模板的DNA序列测定

目的：为确认Tn3-gpt已插入小鼠巨细胞病毒(mouse cytomegalovirus，MCMV)基因组的特定位置，改进大分子病毒DNA的测序方法，建立以230kb DNA为模板直接进行DNA序列测定的方法。方法：待测MCMV的Tr3-gpt插入突变株感染NIH3T3细胞后，从培养液中制备病毒颗粒并从中纯化得到基因组DNA，以此DNA为模板，合成的寡核苷酸为引物，用热循环方法按Promega公司的DNA Cycle Sequencing System试剂盒的方法进行测序。结果：获得纯度较高可直接作为模板进行测序的：DNA，测序所得放射自显影图片条带清晰明亮，间隔正常，分辨率较高，可顺利读出插入位点的MCMV的DNA序列，证实Tn3-gpt插入在特定的位置。结论：长达230kb的大分子病毒DNA可直接作为模板，用热循环测序方法进行测序，无需切割成小片段后才进行测序。     

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.     

黄曲霉毒素氧化酶的酶动力学研究

黄曲霉毒素氧化酶(AFO)是来自Armillariella tabescens的具有降解黄曲霉毒素作用的蛋白质酶.本实验室成功克隆和以原核系统表达了黄曲霉毒素氧化酶,前期的工作中用传统测量表观酶促反应速度的方法对AFO进行了酶动力学的研究,采用了在酶反应的结束点进行分析,因此不能够连续监测酶的反应过程,且实验过程较为繁琐,影响因素较多,对动力学常数的测量存在不够准确的可能.本实验使用等温滴定微量热技术对该酶的酶促动力学进行研究,该方法通过酶与底物的滴定实验直接监测酶反应过程中的热量变化而对酶动力学进行分析,滴定产生一个完整的Michaelis-Menten曲线,通过拟合分析测得黄曲霉毒素氧化酶对AFB1催化的米氏常数KmAFB1=3.34×10-7 mol/L;酶催化ST反应的米氏常数KmST=1.06×10-7 mol/L.对AFB1和ST酶转换系数别为KcatAFB1=2.7 min-1和KcatST=1.7 min-1.结合函分别为△HAFB1=-1.686×107 J/mol,△HST=-9.092×106 J/mol.与传统方法相比,ITC方法在酶动力学研究上具有简便、快速和准确的优点并具有普适性.     

毛霉Amylomyces.rouxii HN0512中内切葡聚糖酶的诱导、纯化及性质分析

Amylomyces.rouxii HN0512经羧甲基纤维素钠(CMC-Na)诱导,可产内切葡聚糖酶,通过正交试验优化诱导培养基,结果在培养基为1％羧甲基纤维素钠、2％麸皮汁、0.2％蛋白胨(以上均为质量分数)时可以诱导出较高活性的酶,用HiTrap QFF阴离子交换层析从培养液上清中纯化得到了具有内切葡聚糖酶活性的P3组分,活性组份的SDS-PAGE分析电泳呈现一条带,经AlphaEaseFCTM软件预测P3的分子质量为18.7 ku;酶反应的最适温度和pH分别为60℃和5.0,在pH 4.0 -7.0范围内稳定性最好,在70℃还能保持50％以上的酶活力;金属离子Fe3+、Ba2+、Fe2和表面活性剂尿素对酶起到了激活作用;反应动力学参数Km和Vmax分别为11.68 mg· mL-1、0.56 μmol·L-1·min-1.本研究获得了一株产内切葡聚糖酶新菌种,并为进一步用基因工程方法克隆并构建重组内切葡聚糖酶基因工程菌奠定了重要的基础.