固定化谷氨酸脱羧酶转化γ-氨基丁酸的研究

研究卡拉胶制备固定化谷氨酸脱羧酶及转化γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件.以本实验室研发的诱导剂对构建的表达谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因工程菌进行诱导,并利用卡拉胶对获得的粗酶液进行包埋制备固定化酶,对影响GAD固定化效果和GABA产量的因素进行研究.最佳固定化条件为卡拉胶浓度1.5%,氯化钾浓度3%,硬化时间2 h;转化GABA的最适条件为反应最适pH为3.8～4.3,最适温度为37℃～43℃,将制得的固定化谷氨酸脱羧酶(IGAD)重复使用7次后,催化活力仍保持在最初值的75%;IGAD在最适底物浓度60 mmol/L下反应时间2 h后谷氨酸转化率达99%,利用IGAD进行连续催化反应,最终GABA摩尔转化率为70.98%,晶体得率为91.90%,晶体纯度94.73%.该法具有较好的操作稳定性和较高的底物转化率,为连续化制备γ-氨基丁酸提供参考.     

γ-氨基丁酸纯化的研究

γ-氨基丁酸(GABA)广泛分布于从哺乳动物到单细胞有机生物体,可以由谷氨酸脱羧酶转化L-谷氨酸或谷氨酸盐而成。γ-氨基丁酸分离、提取及与酶反应偶联体系建立进行研究,分离、提取方法能够提取高纯度产品。     

生物转化法重组谷氨酸脱羧酶合成γ-氨基丁酸

成功构建了一个高效表达大肠杆菌谷氨酸脱羧酶GAD来源的重组质粒pET28a-gadA,并转化E.coli BL21(DE3),工程菌株经0.4mmol/L IPTG或1g/L的乳糖, 37℃诱导表达8h,粗酶液的酶活达到12U/mL,大约是出发菌株E.coli K-12的60倍.工程菌1.15U粗酶液以31g/L L-谷氨酸钠为底物, 37℃、pH 4.0条件下反应4h,γ-氨基丁酸的生成量达到19.57g/L, L-谷氨酸钠的转化率为93%,从而为γ-氨基丁酸的生产提供了很好的前景.     

纤维素酶固定化研究

利用固态发酵法从瑞氏木霉QM9414发酵液中提取纤维素粗酶液,然后将其固定在壳聚糖上,测定粗酶液的酶活力,固定化酶与粗酶的最适pH,最适温度和Km值.结果表明,粗酶液的蛋白质含量为33.33 ug/mL,酶活力为120 IU/mL.固定化酶的最适温度为60℃而粗酶液为50℃,粗酶液的最适pH=5,固定化酶的最适pH=4,固定化酶的Km值3.592 01×10-2,粗酶液的Km值为4.076 04×10-2,表明固定化酶的很多性质均优于游离酶液.     

常见植物组织作为药用或化妆品用SOD来源的价值

通过对天然植物（菠菜和黄瓜）超氧化物歧化酶（SOD）的提取并用氮蓝四唑（NBT）法活力测定，以相同条件下处理的含SOD的医药产品（如大宝SOD蜜）作对照．实验采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）为显色剂，以酶标法测定SOD对其变色反应的抑制作用，以抑制率来反映酶活力强弱．结果表明：菠菜叶SOD活力较高，大宝SOD蜜中SOD活力在多数情况下与同质量的菠菜叶比略偏低，黄瓜果肉中SOD活力最低，菠菜叶具有较良好的抗氧化效果，所以可能作为药用或化妆品用SOD来源．     

地衣芽孢杆菌1.934培养条件的优化

研究了生物肥功能菌——地衣芽胞杆菌1.934 (Bacillus licheniformis)培养条件对菌体生长量的影响.采用了单因素实验和响应曲面法(RSM)设计实验和分析数据.获得了菌体摇瓶培养的最适条件:培养温度35℃,转速为150r/min,接种量为3.6％,pH为7.5.地衣芽孢杆菌在最适条件下培养约20h,淀粉酶的酶活最高,活力可达12.7U/mL培养液.培养约27h得到最大的菌体收益.     

DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究

鉴于纤维素酶研究和生产中,纤维素酶活力测定和酶活力单位的表示方法很不统一的现象,本文研究和分析了３,５－二硝基水杨酸法测定羧甲基纤维素酶糖化力的实验条件,如：温度、ｐＨ、酶促反应时间、ＤＮＳ显色时间、波长等．实验表明：在５０℃,ｐＨ４．６条件下酶促反应时间５ｍｉｎ,ＤＮＳ显色５ｍｉｎ,于４９０ｎｍ处测定ＯＤ值比较适宜．     

三七茎叶中γ-氨基丁酸提取工艺研究

探索三七茎叶中γ-氨基丁酸提取工艺.考察提取的溶剂、时间、次数、温度及物料比5个单因素影响,采用正交实验分析方法确定最佳工艺条件.其结果表明三七茎叶中γ-氨基丁酸的最佳提取工艺为:提取溶剂为水,提取时间3 h,提取次数3次,提取温度60 ℃,提取物料比1 g∶10 mL,在此条件下γ-氨基丁酸的提取率为0.46%.     

工程菌产酶制备GABA测定条件的优化

基于Berthelot显色反应,采用正交设计法优化了测定大肠杆菌工程菌谷氨酸脱羧酶转化L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸含量的条件.实验确定的最佳测定条件为:2.0mL 0.2mol/L pH6.0的醋酸缓冲液(内含0.1mmol/L的PLP,0.2mol/L的L-谷氨酸,稀释70倍),再依次加0.2mmol/L的硼酸缓冲液(pH9.0)1.0mL,0.5mL 6.0%重蒸苯酚和5.0mL 10%次氯酸钠,沸水浴加热10min后,迅速冰浴20min,待溶液出现蓝绿色后,加入60%(v/v)乙醇溶液4.0mL在640nm测定吸光值,绘制出标准曲线来计算GABA的含量.结果表明,该方法简便实用,相对误差小,适合实验室样品的快速检测.     

玉米茎尖培养再生体系的建立

不同基因型的玉米茎尖分生组织在添加不同浓度6-BA(6-苄基嘌呤)的MS培养基上,经过4周愈伤组织诱导培养和4周芽发育培养,获得高频率的丛生芽和再生植株,芽尖倍增数可达3~8芽/茎尖.通过比较试验,确立了诱导丛生芽发生的适宜培养条件和程序,反映了不同基因型的茎尖形成愈伤组织和再生植株的能力不同,从而初步建立了利用玉米茎尖分生组织再生植株的培养体系.     

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

金针菇产木聚糖酶固态发酵条件优化和酶学性质研究

以豆秸粉为主要原料,通过单因素和正交试验确定金针菇(Flammulina velutipes)固态发酵生产木聚糖酶最佳培养条件,并对其粗酶的酶学性质进行了研究.结果表明,碳源为豆秸粉:玉米芯:麸皮=7:2:1,氮源为1.5%的黄豆粉,pH为5,接种量为干料的20%,装瓶量为6 g/100 mL三角瓶装,料水比为1:2.1,培养天数5 d,在此培养条件下得到的酶活力最高,产量可达52 768.91 U/g.粗酶液的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.酶的pH稳定性及热稳定性较好,80℃时相对酶活力仍保持在40.41%.     

米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定

为了解米曲霉纤维素酶在物料分解过程中的作用,从米曲霉沪酿3.042成曲中提取粗酶液,利用DNS法分析了粗酶液中外切酶、内切酶及β-葡萄糖苷酶的活力.用刚果红染色法确定了沪酿3.042成曲粗酶液中含有4种内切型纤维素酶,分别称为Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ和Cx酶Ⅳ.经DEAE-Cellulose-52离子交换层析,0.15,0.20,0.25,0.30mol/L NaCl洗脱峰均测得内切型纤维素酶活性,制备电泳纯化得到4个内切型纤维素酶组分,SDS-PAGE结果显示,Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ为单体酶,分子质量分别为31 800,34 000,26 000u,Cx酶Ⅳ含有4个亚基,分子质量分别为14 000,23 600,26 000,33 500u.粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为4.0.     

甘蔗多酚氧化酶酶学特性及应用研究

对甘蔗多酚氧化酶(PPO)进行提取和部分纯化,研究了PPO的酶学特性.结果表明:以邻苯二酚为底物,甘蔗PPO酶促反应米氏常数Km为54.4 mmol/L,米氏方程:V=1250[S]/(54.4+[S]).蔗汁中邻位多酚类物质是甘蔗PPO的最适反应底物.最适反应条件为:pH值6.2,40℃;该酶在pH5.8和温度低于3℃0时较稳定.试验了6种甘蔗PPO抑制剂:单独使用柠檬酸、草酸、乙二胺四乙酸(EDTA)对PPO活力抑制效果不明显;70 mg/L亚硫酸氢钠、110 mg/L抗坏血酸、120 mg/L硫代硫酸钠可完全抑制PPO活力.现行甘蔗提汁的浸渗工艺较适合蔗汁酶促褐变反应,应作相应的调整.     

水解胶原蛋白对枯草芽胞杆菌生长的影响

本文测定了不同氮源(水解胶原蛋白CH、蛋白胨、明胶、硝酸钠、氯化铵)对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)生长的影响;考察了CH和玉米浆的不同配比对枯草芽胞杆菌生长的影响;研究以CH为氮源时,不同碳源对枯草芽胞杆菌生长的影响;考查CH对其它细菌发酵的影响.研究发现,在CH为氮源条件下,枯草芽胞杆菌的发酵过程可顺利进行,且微生物的生物量可保持在较高水平;同玉米浆相比,CH能使枯草芽胞杆菌达到较高的生物量;以CH为氮源时,淀粉比葡萄糖、蔗糖更有利于枯草芽胞杆菌的生长;除了枯草芽胞杆菌以外,大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 15489)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis CICC 20031)也能有效利用CH.这表明,在实验条件下水解胶原蛋白(CH)可以作为多种微生物发酵的氮源.     

提取蜗牛内脏废弃物中纤维素酶的工艺条件研究

利用白玉蜗牛的内脏废弃物,对蜗牛纤维素酶的提取工艺条件进行了实验研究.采用正交实验与神经网络相结合的方法,建立了蜗牛纤维素酶活力与提取工艺因素之间的神经网络模型.通过基于模型的优化和具体实验,获得了最佳提取工艺条件是:蜗牛纤维素酶的提取时间为12 h,pH值为5.0,提取温度为0℃,盐析饱和度为70%,此条件下,纤维素酶粗品的最高酶活力为3.186 U.mL-1.     

一株产耐高温漆酶真菌的筛选

从安徽省合肥市西郊的大蜀山上采集了40余株木腐真菌,将其在含有α-萘酚的麸皮汁平板上分离纯化后,根据菌落周围产生紫色氧化圈的显著程度筛选出4株漆酶活性较高的菌株,将这4株真菌进行摇瓶培养,测定并比较它们所产漆酶的活性,得到一株产酶活力最高的菌株SY04.菌株SY04在液体培养3d后粗酶液漆酶活力为330U/mL,在对其漆酶粗酶液进行活性分析后发现,该菌所产漆酶在60℃下保温30min后,活性不受明显影响,其最适反应温度为60℃.该菌所产漆酶具有较高的最适反应温度和热稳定性,具有一定的研究和应用价值.     

有机相中脂肪酶催化拆分环氧丙醇的研究

用正交实验方法筛选出有机相中酶促拆分环氧丙醇反应的最适酶源为猪胰脂肪酶(PPL ) .考察溶剂、酰基供体和加酶量对反应的影响 ,确定有机相中酶促拆分环氧丙醇的最适反应条件     

酶电极法测定谷氨酸片中谷氨酸含量

以谷氨酸氧化酶(EC 1.4.3.11)与过氧化氢电极构成电流型酶电极,研究了谷氨酸酶电极分析法的各种分析条件及参数,并与旋光法对比测定谷氨酸片中谷氨酸含量。结果显示酶电极法测定结果与旋光法测定结果之间有较好的一致性,采用酶电极法测定谷氨酸片中谷氨酸含量具有专一性高、成本低、分析速度快等优点。     

生物酶法合成L-茶氨酸和聚谷氨酸的高效同步分离纯化

利用γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GGT,EC 2.3.2.2)催化,以谷氨酰胺和乙胺为底物进行酶反应.反应后主要成分为L-茶氨酸和聚谷氨酸(poly γ-glutamic acid,PGA),杂质有氯离子、乙胺以及少量谷氨酰胺和谷氨酸.通过弱酸性阳离子树脂和弱碱性阴离子树脂...