青蛤(Cyclina sinensis)亲环素A基因的克隆与鳗弧菌刺激后的表达分析

采用SMART-cDNA文库和高通量测序方法,筛选出青蛤亲环素A基因(CypA)的全长cDNA.采用荧光定量PCR法分析该基因在鳗弧菌刺激后的表达情况,并对青蛤Cyp A基因进行原核表达与蛋白纯化.结果表明,青蛤CypA基因全长共962 bp,其中5′UTR为87 bp,3′UTR为346 bp,开放阅读框长度为495 bp,可以编码164个氨基酸,理论相对分子质量约为19.39 kDa,等电点约为5.25.在菌液侵染刺激条件下,刺激3 h后表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.本研究成功表达了重组CypA蛋白,并运用镍离子交换柱法分离纯化出该蛋白,其相对分子质量约为19 kDa.     

人类磷酸泛酰巯基乙胺结合蛋白新基因的分离和鉴定

在对AD293和HEK293进行差减杂交以探索两者在吸附和凋亡特性上的差异时,从AD293的高表达文库中分离得到一段新的cDNA片段.从人类胎脑文库克隆得到该基因,全长2 745 bp,编码的蛋白含518个氨基酸,被预测为磷酸泛酰巯基乙胺结合蛋白.该基因在染色体上定位于2p22.3,包含8个外显子.该cDNA编码的蛋白序列含有一个凋亡抑制蛋白5结构域,外皮蛋白重复片段和铜结合辛肽重复片段.RT-PCR分析显示该基因在人类正常组织和癌组织中广泛表达,但在癌组织中表达量相对较低,提示其可能对细胞凋亡有抑制作用.该基因在进化过程中高度保守.     

大黄鱼cyp19a/b基因的克隆与表达分析

克隆得到了调节雌雄激素平衡的大黄鱼cyp19a/b基因,cyp19a基因c DNA全长1805 bp(NCBI登录号:FJ800566),其中开放阅读框1557 bp,编码518个氨基酸;cyp19b基因c DNA全长2268 bp(NCBI登录号:FJ800567),其中开放阅读框1503 bp,编码500个氨基酸.荧光定量PCR分析显示cyp19a基因在性腺中有明显的表达,且在卵巢中的表达量极显著且高于精巢;在肌肉、脑、肝脏、肾脏、脾脏等组织器官中基本不表达.而cyp19b基因在脑、脾脏和肝脏中有较高表达,在性腺和其他器官中基本不表达.     

甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.     

人新的PLP基因全长cDNA的克隆与分析

在批量分离与脑发育相关的基因克隆时,从人3个月胎脑cDNA文库中得到一全长2261bp的cDNA克隆.其开放性阅读框架编码一个含有551个氨基酸残基的蛋白质,此蛋白与一种推测的细胞结构调节蛋白parelemmin同源,故命名为PLP(paralemmin-like protein).GenBank接受号为AF132731.Northern杂交显示该基因只有一个转录本,大小与获得的该克隆吻合.组织表达谱分析发现该基因在成人心脏、骨骼肌中的表达量高于其他组织.     

青岛文昌鱼肾上腺髓质素基因的克隆、组织特异性表达和生物信息学分析

用PCR技术在青岛文昌鱼中克隆到肾上腺髓质素(AM)基因的全长,命名为BjAM基因.序列分析发现BjAM基因全长1805bp,开放阅读框366bp,5'-UTR为82bp,3'-UTR为595bp;进行生物信息学分析发现,BjAM蛋白序列具有AM家族成员典型的保守关键位点,预测BjAM与AM1是直系同源,与脊椎动物AM1具有类似的生物学功能.组织特异性表达分析发现BjAM在各个组织中均有表达,鳃、脊索、肝盲囊和后肠中的表达量较高.头索动物文昌鱼中AM基因克隆和生物信息学分析为进一步构建原核表达载体、探究AM蛋白的功能奠定了基础.     

一个麻疯树C2H2型锌指蛋白基因JcZFP1的克隆与表达分析

从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个C2H2型锌指蛋白基因,JcZFP1,全长931bp,开放阅读框全长735bp,编码244个氨基酸残基,等电点pI=7.0,分子量PA=27.38kD.C2H2型锌指结构位于第81至103个氨基酸残基中,包括植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH.在该基因的顺式作用元件上发现了与生长发育和逆境胁迫相关的启动元件.荧光定量PCR(qPCR)检测发现,JcZFP1基因在麻疯树各器官中的表达量依次为:绿果皮花叶根茎种仁,且幼嫩器官表达量高于成熟器官;对麻疯树幼苗进行低温、干旱胁迫时,JcZFP1基因的表达量明显增加,表明该基因可能在麻疯树的生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用.     

牦牛UCP1基因生物学特性及组织表达分析

旨在克隆牦牛解偶联蛋白1(UCP1)基因序列,并对其进行生物信息学分析,进一步研究该基因在牦牛各组织的表达规律.以牦牛为实验对象,利用RT-PCR克隆得到牦牛UCP1基因全长序列,生物信息学分析牦牛CDS区,qPCR检测UCP1基因在牦牛不同组织中的表达模式.结果表明,UCP1基因全长为954 bp(GenBank No.MW345537),其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)全长为942 bp,编码313个氨基酸.蛋白分子特性预测UCP1蛋白为不稳定疏水性蛋白,存在跨膜结构域以及多个磷酸化位点.二级结构和三级结构预测显示,UCP1蛋白由无规则卷曲、α螺旋和延伸链三者交替出现.牦牛UCP1基因的核苷酸和氨基酸序列与普通牛的相应序列相似度最高,同源性分别为97.63%和96.76%;与斑马鱼的核苷酸序列和氨基酸序列相似度最低,分别为62.58%和64.29%.组织表达分析发现UCP1在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脂肪、背肌、半腱肌中均有表达,但在肾中的表达量最高,肾与其他组织之间差异显著(P0.05).不同品种牦牛UCP1基因的差异表达分析发现,其在麦洼牦牛背最长肌、肝中的表达量均显著高于金川牦牛(P0.05和P0.0001).这些结果为丰富牦牛UCP1基因的功能研究提供了参考依据.     

睾丸组织高表达新基因THE的克隆及表达特征分析

以Homo.sapiens brain为库,选取编号为CA423810的EST序列,联网到NCBI调用Blast服务器分析,该EST序列是一个代表新基因的未知序列.以该序列作为电子探针,通过Internet采用Blast软件进行GenBank的EST数据库检索,获得了该序列的电子延伸产物EST重叠群.经与人类基因组草图进行序列校正,获得了全长为2 232bp的cDNA序列.利用NCBI的ORFfinder服务器,分析发现该序列具有完整的阅读框架,从而确定了基因的全长cDNA序列.该基因定位于染色体上的5q22,编码由388个氨基酸组成,分子量为44859的蛋白质.运用RTP-CR技术,以新基因电子克隆全长cDNA序列设计基因特异性引物,以11例癌组织及相应的正常组织的cDNA、人胎脑cDNA文库和人睾丸cDNA文库为模板扩增目的片段,并以看家基因GAPDH为内对照,检测目的基因的mRNA表达水平.研究结果表明,新基因只在睾丸组织中高表达,在直肠癌、结肠癌、宫颈癌、胃癌等的癌组织及相应的正常组织中都无明显的表达.因此将该新基因命名为睾丸组织高表达基因(testis high expression,THE).以上结果提示,THE基因可能是在人脑中表达的同一基因的不同剪接本.关键词检索UniGene数据.     

猪GPR84基因克隆和组织表达图谱分析

本研究以长白猪(Landrace)小肠cDNA为模板,克隆游离脂肪酸家族受体GPR84基因cDNA全长.GPR84基因cDNA全长1243bp,编码396个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠、牛等哺乳动物的GPR84氨基酸序列一致性分别为90.2%、83.8%、82.8%、89.4%;结构分析表明猪GPR84含有保守的七次跨膜结构域.采用RT-PCR方法,对家猪GPR84基因进行组织表达分析.结果显示:GPR84在家猪各组织中均有表达.其在下丘脑,肺,肝脏及肠末端分区等组织中表达量较高.     

家猪BMP-2、BMP-3基因克隆及其组织表达探究

本研究以长白猪(Landrace)肺cDNA为模板,扩增获得猪骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-3基因的cDNA全长.BMP-2基因cDNA全长为1742bp,编码395个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-2基因的氨基酸序列一致性分别94.18%,95.4%,95.2%,90.3%,90.60%;BMP-3基因cDNA全长为1639bp,编码475个氨基酸的前体蛋白,猪与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-3氨基酸序列的一致性分别是84.7%、87.7%、82.3%、80.4%、79.5%.采用RT-PCR方法,对BMP-2、3基因在家猪主要组织的表达进行探究.结果显示:BMP-2在所有组织中均有表达;而BMP-3在脑、肺、小肠中表达量较高,其他组织中表达量弱.     

冬凌草PAL基因的克隆及表达分析

苯丙氨酸解氨酶是植物酚酸类化合物合成通路途径中的关键酶。迷迭香酸是冬凌草中的重要的酚酸类活性物质,具有抗菌消炎等药用功效。为了研究PAL基因在冬凌草酚酸类物质合成中的作用,采用RT-PCR技术克隆冬凌草PAL基因,得到序列全长1 116 bp的cDNA,最长的开放阅读框522 bp,编码173个氨基酸,相对分子质量为25.45 kD,GenBank登录号为MK304488。通过生物信息学分析,推测其为游离蛋白,三级结构的建模结果支持二级结构由19段α-螺旋组成的预测。qPCR结果显示,IrPAL基因在冬凌草叶片中表达量最多,茎次之,根中最少。该研究首次获得了IrPAL基因的全长cDNA序列,并检测在冬凌草各组织中的表达差异,为后续进一步研究IrPAL基因在冬凌草迷迭香酸合成途径中的功能奠定了基础。     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达

热休克蛋白70(HSP70)是一种重要的功能蛋白.利用RACE和基因克隆等分子生物学技术,获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)HSP70全长cDNA序列,全长共2 189 bp,包括110 bp的5′UTR(untranslated regions)、126 bp的3′UTR和一个1 953 bp的开放阅读框(ORF).ORF可编码650个氨基酸残基,总分子质量约为71.2 ku,pI为5.38.同源蛋白的比较结果显示,拟穴青蟹HSP70序列与其他一些物种具有很高相似性,推测HSP70基因具有很高的遗传保守性,而基于HSP70氨基酸序列比对而绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测雌性拟穴青蟹一些组织中的HSP70表达,结果显示各待测组织中均能扩增得到HSP70,说明HSP70在拟穴青蟹为组成型表达.其中,HSP70在卵巢中表达量最高,其次为脑神经节,推测这与HSP70作为分子伴侣的功能相关.     

家蚕非编码RNA Bm-152功能初探

Bm-152是前期研究中发现的一个在家蚕丝腺中高表达的非编码RNA.采用实时荧光定量PCR技术对Bm-152在家蚕5龄到预蛹期不同发育天数丝腺中的表达谱进行检测.同时,在个体中过表达Bm-152,检测Bm-152可能参与的信号通路.结果显示,Bm-152在家蚕5龄幼虫丝腺发育过程中无明显的变化规律,但在吐丝第1天表达量较高,随后表达量又下降.通过在血淋巴中注射2μg piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]过表达载体,48h后发现Bm-152在丝腺组织中无明显过表达,但在非丝腺组织中可实现明显过表达,且表达量上调1.66倍;蜕皮激素信号通路基因Usp在非丝腺组织中上调1.95倍,E75A在非丝腺组织中上调2.26倍,保幼激素信号通路基因Met在非丝腺组织中上调1.79倍.表明非编码RNA Bm-152可能通过蜕皮激素和保幼激素信号通路参与家蚕发育,该结果为进一步探索Bm-152的功能提供了方向.     

拟穴青蟹ANT2基因的克隆与低温胁迫表达分析

腺苷酸转移酶(ANT)是线粒体中最丰富的蛋白质之一,其主要作用是介导ADP/ATP在细胞质和线粒体基质之间的运输.为探讨该基因在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)低温适应中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增技术(RACE)等技术,从拟穴青蟹中获得了ANT2的cDNA全长序列,并运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测了ANT2在不同组织和不同温度下的表达谱.该序列全长1 348bp,开放阅读框(ORF)为930bp,编码309个氨基酸残基.同源分析显示,该蛋白具有3个保守的线粒体跨膜功能结构域,形成能量分子传导转运通道,催化细胞质中ADP和线粒体内ATP的跨膜交换.qPCR结果表明ANT2基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达,且表达量不同,表明ANT2基因具有组织表达特异性.第1期仔蟹在10,15,20,25℃不同温度条件下,在1,3,12,24,36h,10和15℃组表达量显著低于20和25℃组(p0.05);且在1,3,6,12,24h,10℃组的表达量显著低于15℃组表达量(p0.05).15℃组在48h内,ANT2呈现高低起伏的表达模式.拟穴青蟹第1期仔蟹ANT2基因表达变化,提示该基因与能量代谢功能相关,可能参与拟穴青蟹低温胁迫应答.     

松墨天牛原肌球蛋白基因的克隆和表达检测

利用先前构建的cDNA文库和RACE方法,克隆了松墨天牛原肌球蛋白基因的cDNA全长,该序列长1 203 bp,命名为MaTm(GenBank登录号:KM099072),其中开放阅读框长852 bp,编码283个氨基酸.MaTm的氨基酸序列与赤拟谷盗 (Tribolium castaneum)相似性最高,为97%,与家蚕相似性 (Bombyx mori)为94%.松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上.用 RT-qPCR 分析了MaTm的相对表达量,结果显示:蛹和幼虫的表达量低于成虫;成虫足和头的表达量高于对照;在幼虫各组织中均有表达,且差异显著(p0.05),其中在体壁的表达量最高.     

鲤鱼LGP2的基因克隆与表达

利用反转录-聚合酶链式反应和互补脱氧核糖核酸(cDNA)末端快速扩增技术克隆得到鲤鱼的遗传和生理学实验室蛋白2(LGP2)基因的cDNA全长,并对其在鲤鱼抵抗病毒和细菌感染过程中的免疫作用进行研究。结果表明:鲤鱼的LGP2的cDNA全长共2 978 bp,开放阅读框为2 037 bp,编码679个氨基酸;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测鲤鱼的LGP2的信使核糖核酸(mRNA)表达于所有被测组织中,且在鳃和脑中的表达量较大,而在性腺和血液中的表达量较小;采用poly I:C和嗜水气单胞菌腹腔注射刺激鲤鱼后,各组织中LGP2的mRNA表达量均有所增大;LGP2是鲤鱼以依赖维甲酸诱导基因I样受体(RIG-like receptors,RLR)信号通路的方式进行抗病毒和抗细菌天然免疫过程中的重要调节因子。     

甜菜夜蛾P450基因的克隆及组织特异性分析

为获得甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)P450基因序列并分析其分布的组织特异性,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到了该基因的cDNA全序列:全长2565bp,包含1010bp的3’非编码区域和42bp的5’非编码区域,开放阅读框(ORF)长1515bp,编码504个氨基酸,分子量为57.74kD,理论等电点为8.01;包含2个糖基化位点,2～21aa为跨膜结构.同源比对结果表明,SeP450与其它昆虫的P450基因拥有同样的2个保守结构域:CAFG、AG\ET.SeP450与棉铃虫蛾HelicoverpaarmigeraP450同源性最高,达74％;系统发育分析也表明二者亲缘关系较近.同时RT-PCR结果显示SeP450mRNA在中肠、脂肪体等多种组织中都有表达,其中中肠表达量最高.