斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

饲料添加剂硒和谷胱甘肽对微囊藻毒素胁迫下罗非鱼肝脏去毒相关基因诱导表达的影响

为从分子水平探讨饲料添加剂硒(Se)和谷胱甘肽(GSH)对淡水养殖鱼类肝脏微囊藻毒素胁迫下去毒分子机理的影响,实验杂交罗非鱼一组喂食含0.15 mg/kg Se的富硒酵母粉饲料,一组喂食含普通酵母粉的饲料,喂食一个月以上;实验尼罗罗非鱼一组喂食含1 g/kg GSH的饲料,一组喂食普通饲料,两组均饱食10 d.所有实验组再均分两组,一组腹腔注射磷酸缓冲液(PBS),一组按体质量注射腹腔注射50μg/kg微囊藻毒素-LR(MC-LR),24 h后分离肝脏组织.以β-肌动蛋白作为外参照,采用半定量RT-PCR方法研究Se和GSH分别对罗非鱼肝脏去毒相关基因转录水平的诱导改变.结果表明,未喂食Se的实验组,杂交罗非鱼肝脏alpho-可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGSTA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)基因mRNA表达水平在腹腔注射50μg/kg MC-LR 24 h后,均较PBS组有诱导趋势;Se+MC-LR组sGSTA和GPX基因mRNA表达水平,均较Se+PBS组略低,可能与添加剂的低剂量添加相关.喂食GSH的实验组,尼罗罗非鱼腹腔注射MC-LR组,肝脏sGSTA基因mRNA表达水平较PBS组有诱导趋势;Se+MC-LR组GPX基因mRNA表达水平,较Se+PBS组有升高趋势,而sGSTA和rho-可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGSTR)基因mRNA表达水平则轻微降低.本实验首次从基因表达水平比较研究了Se和GSH对罗非鱼微囊藻毒素压力情况下,肝脏去毒酶基因表达的影响变化,为Se和GSH饲料添加剂在鱼类饲料中的合理添加提供分子水平的理论依据.     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

鳜属3个物种的遗传多样性分析

本研究在实验室已有的转录组结果的基础上,从测序结果中随机选出部分微卫星位点进行多态性研究,并利用其中25个具有多态性的SSR(simple sequence repeat)位点,对3个鳜属物种斑鳜、翘嘴鳜和大眼鳜进行遗传多样性研究,分析其遗传结构和亲缘关系.实验结果显示,在3个野生物种中共检测到324个等位基因;每对引物检测到的等位基因数为3~23个;平均等位基因数为12.96个.其中共有21个位点属高度多态位点,其平均观测杂合度为0.523 4,平均期望杂合度是0.794 4,平均多态信息含量为0.701 0,这表明3个物种在各检测位点中具有较好的多态性.对数据进行F-检测,25个微卫星位点的Fst值为0.040 0~0.634 0,平均Fst值是0.200 0,说明3个鳜属群体间的分化程度存在差异,在部分位点处,分化程度较高.斑鳜和大眼鳜间Nei氏遗传距离最大,为1.773 4;翘嘴鳜和大眼鳜的遗传距离最小,为0.371 4.根据遗传距离进行的UPMEGA法聚类分析显示翘嘴鳜和大眼鳜聚为一支,斑鳜独自为一支.     

草鱼过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)基因 cDNA序列的克隆及其组成型表达

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是核激素受体超家族成员之一,分α,β,γ 3个亚型,PPAR具有多种生物学效能,对其基因进行研究将有助于揭示草食性鱼类对营养物利用规律及其机制.通过简并引物克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PPAR基因cDNA核心序列,应用3'RACE技术扩增该序列的3'末端序列,并对其进行序列分析,最后用荧光定量PCR方法比较草鱼肝脏、脑、脾脏、肌肉、脂肪和心脏的PPARα、PPARβ和PPARγ基因mRNA相对表达水平.序列分析结果表明,草鱼PPARα、PPARβ和PPARy基因cDNA核心序列片段大小为631 bp,604 bp和651 bp,分别编码210、201和217个氨基酸,PPARy经3'RACE后共获得大小为1 331 bp的片段,编码337个氨基酸.草鱼与鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Danio rerio)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)等鱼类PPAR氨基酸序列同源性很高,为71.4%～96.1%;与人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)等哺乳动物PPAR氨基酸序列的同源性也较高,为65.0%～77.6%;与非洲爪蟾(Xenopus laevis)等两栖动物PPAR氨基酸序列的同源性约为67.0%.荧光定量PCR结果表明,草鱼PPARα于肝脏,PPARβ于肝脏、肌肉和心脏,PPARγ于肝脏的表达相对较高.相同物种不同PPAR亚型的同源性较低,而不同物种同型PPAR同源性很高,反映了不同亚型在结构上的差异,这与其在功能上的差异是相一致的.     

翘嘴鳜淀粉酶基因SNPs和微卫星位点多态性的检测

本研究主要检测翘嘴鳜淀粉酶(amylase,AMY)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和微卫星位点多态性.实验采用PCR产物直接测序法(PCR-direct sequencing,PCR-DS)检测翘嘴鳜AMY基因组序列的SNPs和微卫星位点,并使用创造限制酶切位点PCR法(created restriction sites PCR,CRS-PCR)和PCR-DS法对SNPs进行分型,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测AMY基因微卫星位点的多态性.实验结果发现AMY基因第1内含子有一个SNP位点A1,第5内含子有3个SNPs位点(A2、A3和A4);此外,第5内含子中还存在一个微卫星位点B1,共检测到4个等位基因,有9种单倍型.在翘嘴鳜群体中,4个SNP位点呈中度遗传多样性,而微卫星位点表现出高度遗传多样性.     

微囊藻毒素和脂多糖对鲢鱼和草鱼肝脏去毒相关基因活体诱导表达的影响

采用50μg·(kg体质量)-1的微囊藻毒素·LR(MC-LR)、2 mg·(kg体质量)-1的脂多糖(LPS)和50μg·(kg体质量)-1 MC-LR+2 mg·(kg体质量)-1 LPS分别活体腹腔注射鲢鱼、草鱼,采用实时荧光定量PCR方法测定MC-LR和LPS对鲢鱼、草鱼肝脏alpha-谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)、rho-谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和解偶联蛋白2(UCP2)等去毒相关基因活体诱导表达的影响.结果表明,鲢鱼、草鱼GSTA和GSTR的不同诱导变化除与两种淡水鱼类对毒素的耐受性相关外,还与毒索剂量、诱导时间等因素相关.LPS对GSTA和GSTR基因组成型、诱导型的不同作用,可能与调制因子LPS对不同生态习性淡水鱼类肝脏GST基因表达水平的调制作用不同有关.UCP2与GPX也分别在抑制过量ROS发生方面与肝脏抗氧化胁迫等方面起重要作用.     

3种淡水鱼GSTR的cDNA克隆与肝脏组成型表达比较

比较不同生态习性淡水鱼类微囊藻毒素去毒能力与其肝脏Ⅱ相去毒酶Alpha-及Rho-谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-tmnsferase,GST)基因组成型表达之间的关系.采用RT-PCR及RACE方法成功克隆鲢鱼(Hy-pophthalmichthys molitrix)、尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)、草鱼(Ctenophatyngodon idellu)肝脏Rho-GST(CSTR)基因cDNA全序列.应用半定量PCR方法以β-肌动蛋白为外参照,研究鲢鱼、尼罗罗非鱼、草鱼肝脏Alpha-GST(CSTA)及GSTR基因的组成型表达水平.结果表明,3种淡水鱼类微囊藻毒素去毒基因GSTR序列全长分别为1078 bp、904 bp、1104 bp.鲈形目鱼类的罗非鱼GSTR基因组成型表达相对较高,而鲤形目鱼类的鲢鱼、草鱼GSTA基因组成型表达相对较高.可见不同生态习性淡水鱼类GST基因组成型表达的高低可能与3种淡水鱼类生态习性及去毒能力有关,但对于不同生态习性淡水鱼类去毒能力的分子机制尚待进一步研究.     

草鱼脂肪酸去饱和酶和延长酶基因cDNA全序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中控制高不饱和脂肪酸(HU-FA)合成的脂肪酸去饱和酶(FAD)和脂肪酸延长酶(ELO)基因cDNA全序列.结果表明,草鱼FAD基因cDNA全长为1 994 bp,开放阅读框(ORF)为1 332 bp,编码444个氨基酸...     

翘嘴鳜EST-SSR标记的开发及3个群体遗传多态性分析

为保护野生翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)的种质资源以及遗传育种,本研究从翘嘴鳜的EST文库中开发微卫星并筛选出22对具有多态性的微卫星标记,对来自陆水水库(赤壁)和沅江流域(常德、怀化)的3个野生群体进行了遗传多样性分析.实验结果显示,这些标记在3个群体中均表现出了丰富的多态性;共检测到134个等位基因;各基因座观测等位基因数4～8个;平均等位基因数为6.090 1;观测杂合度0.675 4;期望杂合度0.748 7;多态信息含量0.701 0,表明3个翘嘴鳜群体在各检测位点中具有较好多态性.对数据进行F-检测,平均Fst值为0.038 3,说明群体间的遗传分化程度低;而群体遗传相似度和遗传距离的计算结果显示:常德和怀化群体的遗传相似度最大,遗传距离最小;而常德与赤壁群体的遗传相似度最小,遗传距离最大.这恰恰与翘嘴鳜群体的流域分布一致.