猪肝脏和肌肉肉碱脂酰转移酶Ⅰ基因片段克隆及序列分析

分别从金皮F2代猪的肝脏、第十肋背最长肌中提取总RNA,并根据报道的猪L-CPT ⅠcDNA和M-CPT Ⅰ cDNA序列分别设计引物1和引物2,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得两条长度分别为733 bp和510 bp的片段,克隆于pUCm-T Vector后进行序列分析.结果表明,长度为733 bp的片段为L-CPT Ⅰ基因cDNA的部分序列,编码243个氨基酸,而长度为510 bp的片段则为M-CPT Ⅰ基因cDNA的部分序列,编码169个氨基酸.得到的两条基因片段与报道的猪L-CPT Ⅰ cDNA和M-CPT ⅠcDNA部分序列同源性分别为99.59%和99.61%.     

草鱼原肌球蛋白基因的克隆及其组织表达

为揭示原肌球蛋白基因在草鱼肌肉中的作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得了草鱼原肌球蛋白基因c DNA,并对该基因在普通草鱼和脆肉鲩不同组织中的表达情况进行研究分析。结果表明原肌球蛋白基因c DNA全长序列为1 705 bp,包含387 bp的5′UTR序列,1 307 bp的3′UTR序列和855 bp开放阅读框(ORF)。其ORF编码284个氨基酸。系统进化分析表明普通草鱼与斑马鱼、墨西哥脂鲤的原肌球蛋白基因核苷酸同源性分别是93%和87%,氨基酸同源性分别是96%和93%。在聚类上普通草鱼原肌球蛋白基因与其他鲤科鱼类同源性较高,表明亲缘关系最近,与传统分类相一致。Real time-PCR结果表明原肌球蛋白基因在所检测的普通草鱼和脆肉鲩7个组织中均有表达,原肌球蛋白基因在普通草鱼腹肌中表达最高,其次为前肠。原肌球蛋白基因在脆肉鲩腹肌中的表达低于普通草鱼,而脆肉鲩中肌肉、肝脏、肾脏、前肠、后肠中原肌球蛋白基因表达量大于普通草鱼相对应组织,但差异不显著。     

稀有鮈鲫β-肌动蛋白基因片段的克隆及其同源性分析

采用RT-PCR方法,从稀有鮈鲫肌肉组织中分离和克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列，长度为1029bp，编码343个氨基酸残基．序列分析表明，该cDNA序列与其他物种昏肌动蛋白基因同源性非常高．RT-PCR能够检出该基因在稀有鮈鲫肌肉、眼、脑、心脏、肝、肠、鳃、睥、卵巢等组织中广普表达，在胚胎不同发育时期持续恒量表达．并基于已知的鱼类β-肌动蛋白基因序列构建了进化树．     

草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从草鱼肌肉组织中克隆出MSTN cDNA序列,长度为1764 bp,编码区为1128 bp,共编码375个氨基酸.前体蛋白包括信号肽序列、N端前肽区、蛋白酶水解位点RIRR及C端活性区(含9个保守的Cys残基).多重序列比较表明,草鱼与斑马鱼、黑头软口鲦之间的MSTN序列同源性在94%以上,与其它鱼类之间的序列同源性也较高(78.1%~82.3%),但与鸟类、哺乳类之间的序列同源性则相对较低.系统进化分析显示,不同物种间的MSTN序列同源性基本反映了它们的亲缘关系.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

草鱼胸腺素β11的cDNA克隆及序列分析

以前期构建的草鱼肠道cDNA文库中β胸腺素EST序列为基础,应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术扩增草鱼胸腺素β11（thymosinβ11,Tβ11）的cDNA序列全长（NCBI登录号：HM120850）,该序列长320 bp,5’非翻译区47 bp,3’非翻译区141 bp,包含一个132 bp的开放读码框,编码43个氨基酸残基,蛋白质等电点为5.17,分子大小为4892 Da.与其他脊椎动物的同源性对比结果显示,草鱼与斑马鱼胸腺素β11的同源性最高,达到93.0%.结构预测显示草鱼胸腺素β11拥有典型的β胸腺素家族典型的二级结构.     

鳜鱼(S.Keneri)肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼(S.Keneri)以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一.为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链(MYH)cDNA序列.该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly(A)信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221.6Ku.鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail 1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90%,具高度保守性.通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77%—86%,氨基酸编码序列同源性达80%—92%.采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达.由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达.研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础.     

赤眼鳟β-肌动蛋白基因克隆、组织表达与稳定性分析

为探究赤眼鳟(Squaliobarbuscurriculus)β-肌动蛋白(β-actin)基因的结构和表达特性,本文采用RT-PCR技术和RACE法,从赤眼鳟肝脏中获得了赤眼鳟β-actin cDNA全长序列(GenBank:MT119965),该基因c DNA全长共1 816 bp,由94 bp的5’端非编码区, 594 bp的3’端非编码区和1 128 bp的开放阅读框(95-1222)组成,阅读框共编码375个氨基酸。通过序列比对和系统进化树的构建,赤眼鳟β-actin与鲤科鱼类聚为一支且与鲮鱼、鲫鱼、黄颡鱼等多个物种的β-actin氨基酸同源性都为99%。荧光定量(qPCR)表达分析显示,β-actin在赤眼鳟肌肉、肠、脾脏、皮肤、血液、鳃、体肾、头肾、心脏和肝脏十个组织中都有表达,但不同组织的表达量存在差异。利用Best keeper软件对赤眼鳟体内的延伸因子1(elongation factor 1, EF1)和β-actin基因进行稳定性对比,发现β-actin基因稳定性低于EF1基因。以上结果为赤眼鳟的分子系统进化研究提供证据,也为赤眼鳟功能基因表达研究提供参考依据。     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

草鱼脂肪酸去饱和酶和延长酶基因cDNA全序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中控制高不饱和脂肪酸(HU-FA)合成的脂肪酸去饱和酶(FAD)和脂肪酸延长酶(ELO)基因cDNA全序列.结果表明,草鱼FAD基因cDNA全长为1 994 bp,开放阅读框(ORF)为1 332 bp,编码444个氨基酸...