草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从草鱼肌肉组织中克隆出MSTN cDNA序列,长度为1764 bp,编码区为1128 bp,共编码375个氨基酸.前体蛋白包括信号肽序列、N端前肽区、蛋白酶水解位点RIRR及C端活性区（含9个保守的Cys残基）.多重序列比较表明,草鱼与斑马鱼、黑头软口鲦之间的MSTN序列同源性在94%以上,与其它...     

草鱼过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)基因 cDNA序列的克隆及其组成型表达

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是核激素受体超家族成员之一,分α,β,γ 3个亚型,PPAR具有多种生物学效能,对其基因进行研究将有助于揭示草食性鱼类对营养物利用规律及其机制.通过简并引物克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PPAR基因cDNA核心序列,应用3'RACE技术扩增该序列的3'末端序列,并对其进行序列分析,最后用荧光定量PCR方法比较草鱼肝脏、脑、脾脏、肌肉、脂肪和心脏的PPARα、PPARβ和PPARγ基因mRNA相对表达水平.序列分析结果表明,草鱼PPARα、PPARβ和PPARy基因cDNA核心序列片段大小为631 bp,604 bp和651 bp,分别编码210、201和217个氨基酸,PPARy经3'RACE后共获得大小为1 331 bp的片段,编码337个氨基酸.草鱼与鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Danio rerio)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)等鱼类PPAR氨基酸序列同源性很高,为71.4%～96.1%;与人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)等哺乳动物PPAR氨基酸序列的同源性也较高,为65.0%～77.6%;与非洲爪蟾(Xenopus laevis)等两栖动物PPAR氨基酸序列的同源性约为67.0%.荧光定量PCR结果表明,草鱼PPARα于肝脏,PPARβ于肝脏、肌肉和心脏,PPARγ于肝脏的表达相对较高.相同物种不同PPAR亚型的同源性较低,而不同物种同型PPAR同源性很高,反映了不同亚型在结构上的差异,这与其在功能上的差异是相一致的.     

麻疯树P5CS基因的克隆及原核表达

使用RACE技术,从麻疯树叶片中克隆了Δ1吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,命名为JcP5CS. JcP5CS的cDNA全长2675 bp,包含一个2148 bp的开放阅读框,一个117 bp的5’-非翻译区以及一个410 bp的3’-非翻译区.开放阅读框编码716个氨基酸多肽链,分子量为77.54 kD,预测等电点为6.11.通过与其它物种的P5CS氨基酸序列比对,结果显示,与其他高等植物的P5CS氨基酸序列有很高的同源性.包含谷氨酸激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氢酶两个结构域以及ATP及NAD (P     

太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44基因克隆及分子特征分析

采用RACE技术首次克隆太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44全长cDNA序列,并命名为EpCYP4C和EpCYP44。EpCYP4C基因全长序列2 032 bp,5’非翻译区60 bp,3’非翻译区487 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;EpCYP44全长cDNA序列1 752 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸,5’非翻译区85 bp,3’非翻译区182 bp。经预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白具有CYP450家族蛋白特有的血红素结合区FxxGxxxCxG;而且EpCYP4C蛋白具有CYP4家族基因特征序列EVDTFMFEGHDTT。通过多序列比对和系统进化树分析发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白与近亲真宽水蚤同源性更高,亲缘关系更近。蛋白二级结构预测显示EpCYP4C和EpCYP44蛋白主要以α螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白分布在细胞质和线粒体的可能性较大,这可能与CYP450酶系的解毒代谢机制相关。研究结果说明太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因均为CYP450酶系,且太平洋真宽水蚤EpCYP4C基因属于CYP4家族。对太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因的序列分析为进一步研究EpCYP4C和EpCYP44基因在污染物暴露下的表达奠定理论基础;同时有助于了解海洋桡足类CYP450超家族的分子特征。     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

斜带石斑β-珠蛋白cDNA的克隆和序列分析

从斜带石斑EpinephelusCoioides白细胞cDNA库随机挑取噬菌斑，做为模板，用λTriplEx5'3'长距离插入子筛选引物，进行插入片断的PCR扩增，并进行表达序列探针（ESTs)测定。从中克隆到了血红蛋白β亚基cDNA,cDNA包含长达444bp的开放阅读框，编码147个氨基酸的多肽。用www.expasy.ch网站的compute pI/MW程序计算其可能的相对分子质量为16544，等电点为6.95。其氨基酸序列与草鱼β-珠蛋白Ⅲ的同源性最高，为73.0%。在远端和近端的与血红素结合的组氨酸都是保守的，另外，与其它鱼类及蛙，鸡和人的β-珠蛋白比较，在血红素结合区及亚基结合区的氨基酸残基均是高度保守的。     

草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从草鱼肌肉组织中克隆出MSTN cDNA序列,长度为1764 bp,编码区为1128 bp,共编码375个氨基酸.前体蛋白包括信号肽序列、N端前肽区、蛋白酶水解位点RIRR及C端活性区(含9个保守的Cys残基).多重序列比较表明,草鱼与斑马鱼、黑头软口鲦之间的MSTN序列同源性在94%以上,与其它鱼类之间的序列同源性也较高(78.1%~82.3%),但与鸟类、哺乳类之间的序列同源性则相对较低.系统进化分析显示,不同物种间的MSTN序列同源性基本反映了它们的亲缘关系.     

中国少棘蜈蚣毒腺应激转录因子p8cDNA序列分析

本文报道了中国少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)毒腺应激转录因子p8 cDNA全序列.该cDNA全长838 bp,5’非翻译序列97 bp中含有1个转录起始元件TCATTCT,3’非翻译序列525 bp中含有两个mRNA快速降解信号ATTTTTA,多聚A尾前13b...     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.     

烟草NtCDC48基因的克隆及功能分析

利用裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）系统从烟草BY-2悬浮细胞中分离得到了NtCDC48 cDNA序列， 全长2729bp，包括74bp的5′端非翻译区，2427bp的开放阅读框以及228bp的3′端非翻译区，可读框编码808个氨基酸，推导蛋白含有两个典型的ATPase模块（aa：245—374；518—646）. 在烟草悬浮细胞中过量表达NtCDC48能显著提高烟草BY-2细胞的有丝分裂指数，并导致纺锤体微管列阵的两极结构由相对集中转换为极端弥散状态. NtCDC48GFP融合蛋白在细胞周期M期的亚细胞定位结果表明，NtCDC48随细胞周期进程发生有规律的变化.这些结果表明NtCDC48在植物细胞有丝分裂进程中发挥着重要作用.     

人Oligophrenin 1样(OPHN1L)基因的克隆

将人Oligophrenin 1(OPHN1)基因编码区2406 bp与EST数据库进行同源性分析,得到一个363 bp的EST AA035622与OPHN1基因编码区一致性为62%,该EST与一个cDNA序列AB014521完全匹配.在ABO14521中设计引物与cDNA文库载体臂上引物行巢式PCR扩增并进行5′RACE,在胎盘cDNA文库中获得cDNA序列606bp,与AB014521拼接成一个6906 bp的cDNA序列,其中包含一个2442 bp的开放阅读框,编码813个氨基酸.该cDNA序列的GenBank登录号为AF141884,并经GDB命名委员会命名为OPHN1L基因.OPHN1L基因3′端与大规模测序的BAC克隆AC005348及AC004782完全匹配,从而将该基因定位于5q21.2～q21.3,并由此获得它的部分基因组结构.     

五指山小型猪PMSA6基因cDNA克隆及生物信息学分析

为了对海南五指山小型猪蛋白酶体亚基α型6（proteasome subunit alpha type 6,PMSA6）cDNA基因进行克隆和生物信息学分析,笔者以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到PMSA6全长cDNA,并向GenBank递交了该序列（登录号：FJ358606）．同时运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行了分析,并预测了其编码蛋白的理化性质及二级结构等．生物信息学分析表明：该cDNA全长1029bp,5’非翻译区长96bp,3’非翻译区长192bp,含有一个741bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸．该蛋白的分子量为37．680kD,等电点为8．76．进一步比对分析发现,五指山小型猪PMSA6基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、牛等哺乳动物具有很高的相似性．本研究成功克隆了海南五指山小型猪P肛SA6基因cDNA,并进行了相关生物信息学分析,为进一步研究PMSA6在动物体内的作用机理奠定了基础．     

水稻几丁质酶基因(Oschi)cDNA的克隆及序列分析

 以成功克隆大蕉几丁质酶基因（MpChi-1）时设计的一对引物,采用RT-PCR技术从广亲和水稻品种（Oryza．satival L．Cpslo17）中扩增到一水稻几丁质酶的全长cDNA,长1 115 bp,命名为Oschi;此序列已在GenBank中注册,登录号为EU045451;将Oschi基因核苷酸测序结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索;并将Oschi的cDNA序列及氨基酸序列与大蕉及其它单子叶植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树;结果显示此基因具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构;与大蕉核苷酸序列相比同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,与预测登记的最相近的水稻［Oryza sativa(japonica cultivar-group)］核苷酸序列相比同源性为98%, 氨基酸序列同源性为98%;广亲和水稻Oschi基因与大蕉MpChi-1基因的序列及蛋白结构有较高的一致性。     

鳜鱼（S．Keneri）肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼（S．Keneri）以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一．为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链（MYH）cDNA序列．该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly（A）信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221．6Ku．鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90％,具高度保守性．通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77％86％,氨基酸编码序列同源性达80％-92％．采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达．由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达．研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础．     

枇杷番茄红素β环化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物番茄红素β环化酶（LYC）基因的保守区序列，设计1对PCR引物，以枇杷基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增长约300bp的DNA片段，克隆人pMD-18T载体，测得该基因片段长312bp，编码102个氨基酸，属于开放阅读框的一部分，不含内含子。在GenBank中进行同源性检索表明该序列与苹果番茄红素β环化酶基因同源性为97％，由此推测这个基因属于枇杷番茄红素β环化酶基因。     

RACE法克隆日本三角涡虫β-actin基因

采用cDNA末端快速扩增法(RACE),以日本三角涡虫cDNA为模板扩增β-肌动蛋白(β-actin)基因,对聚合酶链式反应(PCR)产物进行测序和拼接。经与NCBI核酸数据库进行序列比对,结果表明:产物的cDNA长度为1168 bp,开放阅读框ORF长999 bp,编码332个氨基酸,具有actin蛋白家族典型特征。     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1~15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%~65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

鳜鱼(S.Keneri)肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼(S.Keneri)以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一.为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链(MYH)cDNA序列.该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly(A)信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221.6Ku.鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail 1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90%,具高度保守性.通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77%—86%,氨基酸编码序列同源性达80%—92%.采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达.由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达.研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础.     

广西巴马小型猪活化素β_A/β_B基因cDNA克隆与序列分析

目的通过克隆广西巴马小型猪活化素(activin)βA/βB基因cDNA,分析其序列,为研究活化素的生物学功能打下基础。方法提取广西巴马小型猪发情母猪的卵巢总RNA,并以其为模板,以下游特异性引物为反转录引物,在AMV酶作用下合成cDNA;用LA-Taq进行PCR扩增出包括成熟肽在内的activinβA及βB基因的部分序列,把两个序列分别连接到PMD-18载体进行克隆和序列分析。结果包括成熟肽在内的activinβA及βB基因的部分序列长度分别为964 bp和791 bp,两个亚基的序列比较保守,与GenBank上发表的猪activin两个亚基同源性达到99.79%和99.62%。activinβA基因有两个碱基发生突变,其中一个在成熟肽序列上,一个在非编码序列上;βB基因信号肽序列上有三个碱基发生突变,其中一个是同义突变。     

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过ＰＣＲ法扩增出２３６６bp的人乳铁蛋白cDNA、８００bp的山羊β－乳球蛋白基因５′端调控序列,经ＰＣＲ反应连接后,克隆到表达载体pLNCX中,测序结果表明,与ＧeneBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为９９．７４％,山头β－乳球蛋白基因５′端调控序列的同源性为９９．７５％。酶切结果证明得到了正确的重组载体,可用于乳腺生物反应器的研究。利用ＰＣＲ反应直接克隆目的片段,并通过同源序列进行ＰＣＲ连接,极大提高了克隆的速度和准确性,,为基因克隆及其表达研究带来了方便。