猪STAT4、STAT6基因克隆及组织表达研究

本研究以长白猪为材料,克隆了STAT4和STAT6基因的cDNA全长,其中STAT4基因cDNA全长2269 bp,编码748个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物STAT4氨基酸序列一致性分别为97%、98%、96%、96%;STAT6基因cDNA全长2637 bp,编码847个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物的氨基酸序列有很高的同源性,分别为93%、95%、88%和87%.采用RT-PCR方法,本研究对家猪STAT4和STAT6基因进行组织表达分析.结果显示:STAT4在所有组织中都有表达,STAT6在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠等组织中有表达.此外,本研究已将家猪STAT4和STAT6基因编码区序列克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中,并做了初步功能鉴定.     

家猪信号转导及转录激活因子基因3、5a及5b的克隆、剪切变体鉴定及组织表达图谱分析

本研究以家猪为材料,克隆了家猪STAT3、STAT5a、STAT5b基因的cDNA全长,序列分析显示:家猪STAT3基因cDNA编码770个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠STAT3氨基酸序列一致性高达99%;STAT5a基因cDNA编码799个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠氨基酸序列一致性分别为分别为96%,97%,95%,和95%;STAT5b基因cDNA编码787个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠氨基酸序列一致性高达98%.同时,还鉴定到STAT3的一种新剪接变体以及STAT5a的三种剪接变体.采用RT-PCR方法,我们进一步检测了这些基因mRNA在成年家猪各组织中的表达情况.STAT3在除了心脏和肌肉以外的其他被检测组织中均有较高的表达水平;STAT5a在肝脏、肾脏、脾脏、肺和卵巢中有较高的表达水平;STAT5b在所有被检测的组织中均有表达.     

猪GPR84基因克隆和组织表达图谱分析

本研究以长白猪(Landrace)小肠cDNA为模板,克隆游离脂肪酸家族受体GPR84基因cDNA全长.GPR84基因cDNA全长1243bp,编码396个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠、牛等哺乳动物的GPR84氨基酸序列一致性分别为90.2%、83.8%、82.8%、89.4%;结构分析表明猪GPR84含有保守的七次跨膜结构域.采用RT-PCR方法,对家猪GPR84基因进行组织表达分析.结果显示:GPR84在家猪各组织中均有表达.其在下丘脑,肺,肝脏及肠末端分区等组织中表达量较高.     

猪Akt3基因克隆、序列分析及组织表达图谱研究

本研究以长白猪(Landrace)肌肉cDNA为模板,克隆得到长白猪Akt3基因.序列分析结果显示:长白猪Akt3基因cDNA全长1493bp,编码一个含479个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为100%、100%、99.58%、99.79%,具有高度保守性.氨基酸结构分析显示,长白猪Akt3基因都具有典型的Pleckstrin homologous domain(PH)结构域和丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活位点.组织表达图谱分析结果显示:Akt3基因在所有检测的家猪组织中均有表达.此外,本研究还将Akt3基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

猪SOSC1、SOCS3和SOCS4基因克隆及组织表达研究

本文以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆得到长白猪细胞因子抑制因子SOCS-3基因,并首次克隆得到长白猪SOCS-1和SOCS-4基因.此外,还利用长白猪基因组DNA为模板克隆得到SOCS-3假基因(pseudo-SOCS-3).序列分析显示:长白猪SOCS-1基因cDNA编码220个氨基酸的前体蛋白,与人、小鼠、大鼠和牛的氨基酸序列一致性分别为94％、91％、91％和94％;SOCS-3基因cDNA全长690 bp,编码229个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠和小鼠的氨基酸序列一致性高达94％以上;SOCS-4基因cDNA全长1404 bp,整个编码区没有内含子插入,编码441个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠和小鼠的氨基酸序列一致性分别为97％,89％和86％.氨基酸结构分析显示,长白猪SOCS-1,SOCS-3和SOCS-4基因都具有典型的中央SH2结构域和C末端有40个氨基酸的SOCS Box结构域;SOCS-4有长约285个氨基酸的N末端,且没有特殊的结合基序,其长末端存在的生理意义有待进一步研究.采用RT-PCR方法,对长白猪SOCS-1,SOCS-3和SOCS-4基因进行组织表达分析.结果显示它们在所有组织中都有表达.     

猪黑皮质素受体3和4基因克隆及分析

以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆长白猪黑皮质素受体3和4基因(MC3R和MC4R).序列分析显示:长白猪MC3R基因cDNA编码具319个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠和斑马鱼的氨基酸序列一致性分别为86.4%、83.3%、82%和69.7%;MC4R基因cDNA全长1175bp,编码具332个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠的氨基酸序列一致性高达94%以上,与斑马鱼MC4R氨基酸序列享有70.7%的同源性.序列分析显示,猪MC3R和MC4R基因都具有典型的七次跨膜结构域,和短的胞内环和胞外环,且在第五个跨膜域中保守的甲硫氨酸(M)分别替换为异亮氨酸(I)和缬氨酸(V).另外,在猪MC3R和MC4R中还鉴定到保守的半胱氨酸残基,第一个胞内环中保守的PMY基序和N末端的3个N-链接糖基化位点.组织表达图谱分析表明,MC3R主要在大脑和脾中高表达,而MC4R主要在六种检测的组织中都有表达,在肾中表达较弱.     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

猪SOSC5和SOCS6基因克隆及组织表达研究

本文以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆得到长白猪细胞因子抑制因子SOCS-5基因和长白猪SOCS-6基因.序列分析结果显示:长白猪SOCS-5基因cDNA全长1688 bp,编码一个含有536个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为97％、97％、94％和95％;SOCS-6基因cDNA全长1645 bp,编码一个含有535个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为:92％,97％,85％,82％.氨基酸结构分析显示,长白猪SOCS-5和SOCS-6基因都具有典型的中央SH2结构域和C末端有40个氨基酸的SOCS Box结构域;组织表达图谱分析结果显示:长白猪SOCS5基因在大脑、心脏、脾脏、肌肉组织大量表达,在下丘脑、肝脏、肾脏、小肠中也有表达;SOCS6基因在大脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉及小肠均大量表达.此外,本研究还将SOCS-5和SOCS-6基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

猪抑胃肽/葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)基因的克隆与组织表达分析

本研究采用RT-PCR方法,克隆长白猪(Landrace)GIP基因全长cDNA序列,并对其在家猪组织中的表达情况进行分析.结果显示:长白猪GIP(pGIP)cDNA全长435bp,编码144个氨基酸GIP的前体蛋白;该前体蛋白含有信号肽序列,经蛋白酶水解后产生GIP成熟肽.与人、小鼠GIP表达图谱类似,GIP mRNA也在长白猪小肠及肾脏中有较高水平表达.     

猪AIBP基因的克隆与组织表达谱研究

扩增了猪AIBP基因CDS和3′端,测序得到全长935bp的cDNA序列,NCBI登录号为DQ826508。猪AIBP基因编码288个氨基酸,与牛、人、鼠的AIBP氨基酸序列的相似性分别为94%、90%和87%,含有1个YjeF-N保守结构域,有信号肽序列。组织表达分析表明猪AIBP在背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、子宫、睾丸、胚胎和脂肪等组织均有表达。     

家猪STAT1的基因克隆、剪接变体鉴定及组织表达研究

以长白猪(Landrace)cDNA为模板, 克隆STAT1基因cDNA全长.家猪STAT1基因cDNA全长编码757个氨基酸的前体蛋白, 与人、大鼠、小鼠、牛等哺乳动物的STAT1氨基酸序列一致性分别为95％、908％、896％、916％; 同时, 本研究亦鉴定到家猪STAT1的3种剪接变体(分别命名为STAT1 sv1, STAT1 sv2, 和STAT1 sv3).采用RT PCR方法, 进一步检测了STAT1及其3种剪接变体在成年家猪各组织中的表达情况.STAT1和两种剪切变体(STAT1 sv2 和STAT1 sv3)在家猪组织中广泛表达, 而剪接变体STAT1 sv1则在肺和脾脏中有较高表达水平.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

本研究采用RT-PCR方法,首先克隆珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列.结果显示,家鸡PTH3R(cPTH3R)cDNA全长1632bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w)cDNA序列全长1563bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构.此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468bp,编码488个氨基酸,其缺失第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失.利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模.采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析.结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达.     

眼斑拟石首鱼肽聚糖识别蛋白2的基因克隆与组织表达特性

采用同源克隆技术获得了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的肽聚糖识别蛋白2基因(命名为So-pglyrp2).So-pglyrp2的cDNA全长1 729 bp,含有1个1 446 bp的开放阅读框,编码的482 aa前体蛋白带有1个21 aa信号肽;So-pglyrp2基因由4个外显子和3个内含子构成.序列比对分析表明,So-pglyrp2存在1个保守的PGRP结构域,其氨基酸序列与已报道的脊椎动物pglyrp2的同源性最高,一致性为57.1%~82.8%.RT-PCR分析表明,So-pglyrp2基因在肝脏强烈表达,在性腺、肠和胃组织弱表达,在其他组织不表达.研究结果为阐明鱼类pglyrp2基因结构、了解低等脊椎动物pglyrp2的进化地位、探讨鱼类pglyrp2的免疫学功能奠定了坚实的基础.     

长爪沙鼠Eef1a2基因的克隆与同源性分析

目的长爪沙鼠真核蛋白延长因子1a2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,Eef1a2)基因的克隆,测序和同源性分析。方法提取长爪沙鼠骨骼肌组织的mRNA,通过同源扩增和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆Eef1a2 cDNA序列全长。通过DANSTAR软件比对长爪沙鼠和人类、大鼠、小鼠Eef1a2的cDNA和氨基酸序列,并分析其同源性。结果长爪沙鼠Eef1a2 cDNA序列全长1812 bp,编码区(coding sequence,CDs)1392 bp,编码463个氨基酸。其核苷酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为88.6%,94.0%和93.8%;长爪沙鼠Eef1a2氨基酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为100%,99.9%和99.9%。结论长爪沙鼠Eef1a2的核苷酸序列和氨基酸序列均与人、大鼠、小鼠高度同源。因此,长爪沙鼠可能是一种人类Eef1a2基因研究的理想模型。     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。     

大黄鱼cyclin B1和cdc2 cDNA序列特征及组织表达分析

成熟促进因子(MPF)是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子,在配子成熟过程中具有重要作用.MPF由周期蛋白B(cyclin B,CB)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK1,由cdc2基因编码)2个亚基组成.本研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)cyclin B1(Lc-cb1)和cdc2(Lc-cdc2)基因的cDNA序列,并分析了这2个基因mRNA的组织表达特征,为解析MPF在大黄鱼性腺发育和配子成熟的作用机理奠定基础.Lc-cb1基因全长cDNA 1 882bp,可编码397个氨基酸的蛋白;Lc-cdc2基因全长cDNA序列1 151bp,可编码303个氨基酸的蛋白.基于Lc-cb1 cDNA序列推导的氨基酸序列与6种脊椎动物的CB1氨基酸序列有较高相似性(67%~84%),并具有周期蛋白盒、毁坏盒、以及蛋白酶K位点(RRxSK)等CB预期特征.基于Lc-cdc2的cDNA序列推导的氨基酸序列也与其他6种鱼类的CDK1氨酸酸序列有较高相似性(88%~97%),并具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域、ATP结合相关的保守序列(GxGxxGxV)、周期蛋白结合相关的PSTAIRE序列等CDK1的预期特征.可见,本研究克隆获得的2条序列是Lc-cb1和Lc-cdc2 cDNA全长.实时荧光定量PCR结果显示,Lc-cb1和Lc-cdc2的2个基因mRNA表达具有相似的组织特异性,在性腺中mRNA水平均远远高于其他组织,表明Lc-cb1和Lc-cdc2是大黄鱼性腺发育相关的重要基因.     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.