山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

分别提取处于同一发情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对INHA、INHBA基因cDNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究.结果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因编码区均长1083bp,编码360个氨基酸,两品种基因编码区有7处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;INHBA基因编码区均长1278bp,编码425个氨基酸,两品种基因编码区有4处碱基不同,并导致1处氨基酸的差异.藏山羊INHA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P0.05).说明INHA和INHBA基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究.     

牦牛DIO2基因克隆及其在骨骼肌的表达分析

为探索DIO2基因调控牦牛骨骼肌发育及肌纤维类型组成的潜在功能,克隆DIO2基因CDS序列并进行相关的生物信息学分析,以及比较分析其在牦牛骨骼肌的差异表达.结果显示,DIO2基因的CDS全长为789 bp,编码132个氨基酸.序列同源性比对及系统进化树分析发现,牦牛DIO2基因与普通牛的亲缘关系最近,核酸及蛋白序列与普通牛一致;与小鼠的亲缘关系较远,序列同源性仅为86.75%和87.12%,与原鸡的亲缘关系最远,二者的同源性分别为79.17%和76.30%.理化性质预测表明DIO2蛋白为不稳定疏水性蛋白,有跨膜结构域,具有24个磷酸化位点,蛋白结构为无规则卷曲、α-螺旋和延伸链三者交替出现.采用实时荧光定量PCR分析显示,DIO2基因在牦牛的脾、肺等内脏组织表达无显著差异;在背最长肌和半腱肌的表达量显著高于脂肪和肝脏组织(P0.01).此外,DIO2在金川牦牛半腱肌的表达量显著高于麦洼牦牛(P0.05).以上结果为研究DIO2在牦牛骨骼肌的功能提供参考资料.     

牦牛UCP1基因生物学特性及组织表达分析

旨在克隆牦牛解偶联蛋白1(UCP1)基因序列,并对其进行生物信息学分析,进一步研究该基因在牦牛各组织的表达规律.以牦牛为实验对象,利用RT-PCR克隆得到牦牛UCP1基因全长序列,生物信息学分析牦牛CDS区,qPCR检测UCP1基因在牦牛不同组织中的表达模式.结果表明,UCP1基因全长为954 bp(GenBank No.MW345537),其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)全长为942 bp,编码313个氨基酸.蛋白分子特性预测UCP1蛋白为不稳定疏水性蛋白,存在跨膜结构域以及多个磷酸化位点.二级结构和三级结构预测显示,UCP1蛋白由无规则卷曲、α螺旋和延伸链三者交替出现.牦牛UCP1基因的核苷酸和氨基酸序列与普通牛的相应序列相似度最高,同源性分别为97.63%和96.76%;与斑马鱼的核苷酸序列和氨基酸序列相似度最低,分别为62.58%和64.29%.组织表达分析发现UCP1在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脂肪、背肌、半腱肌中均有表达,但在肾中的表达量最高,肾与其他组织之间差异显著(P0.05).不同品种牦牛UCP1基因的差异表达分析发现,其在麦洼牦牛背最长肌、肝中的表达量均显著高于金川牦牛(P0.05和P0.0001).这些结果为丰富牦牛UCP1基因的功能研究提供了参考依据.     

牦牛和黄牛睾丸组织Prdm9基因cDNA序列的比较

为比较牦牛与普通牛Prdm9基因的序列特征,采用RT-PCR和3’-RACE方法,从牦牛和黄牛睾丸组织总RNA中分别获得Prdm9基因的部分cDNA序列,经过拼接后获得了牦牛和黄牛Prdm9基因的完整cDNA序列,长度分别为2580bp和2421bp,编码序列长度均为2091bp,共编码696个氨基酸,氨基酸序列相似性为98.56%.分析显示,牦牛和黄牛Prdm9基因开放阅读框有10个核苷酸同义突变和10个单核苷酸多态性(SNPs),并导致10个氨基酸差异,其中4个位于锌指域.研究结果表明,牦牛和黄牛Prdm9基因结构特征类似,但在锌指域存在一些氨基酸差异,可能会影响该基因的功能.     

猪STAT4、STAT6基因克隆及组织表达研究

本研究以长白猪为材料,克隆了STAT4和STAT6基因的cDNA全长,其中STAT4基因cDNA全长2269 bp,编码748个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物STAT4氨基酸序列一致性分别为97%、98%、96%、96%;STAT6基因cDNA全长2637 bp,编码847个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物的氨基酸序列有很高的同源性,分别为93%、95%、88%和87%.采用RT-PCR方法,本研究对家猪STAT4和STAT6基因进行组织表达分析.结果显示:STAT4在所有组织中都有表达,STAT6在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠等组织中有表达.此外,本研究已将家猪STAT4和STAT6基因编码区序列克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中,并做了初步功能鉴定.     

大熊猫核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的cDNA克隆及序列分析

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料,成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫L30亚基基因的表达序列长为388bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,并含有6个功能位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性,其表达序列同源性分别为93.97%,96.26%,89.66%和89.94%,其编码的氨基酸序列同源性分别为99.13%,98.26%,99.13%,99.13%,且其蛋白质的高级结构相似性也很高.     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.     

牦牛GPRIN3基因的克隆及组织表达分析

为探索GPRIN3基因的生物学特性,以麦洼牦牛为试验材料,利用RT-PCR技术扩增GPRIN3基因编码区序列并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测GPRIN3在牦牛不同组织的mRNA表达水平.结果表明,克隆得到GPRIN3基因编码区序列大小为2 343 bp,编码780个氨基酸残基;麦洼牦牛与野牦牛氨基酸序列相比,一致性为99.62%,共有3个位点发生突变,分别是103(G→R)、366(T→M)、404(E→K).系统进化分析显示,牦牛与野牦牛亲缘关系最近,其次是普通牛,与黑猩猩的亲缘关系最远;含有GRIN-C超家族保守功能结构域;实时荧光定量PCR结果表明,GPRIN3在麦洼牦牛肺脏组织中表达量最高,其次是肝脏,在臀肌中表达量最低.本研究为进一步探讨牦牛GPRIN3基因及其编码蛋白的结构和功能提供理论基础,为牦牛分子育种提供新思路.     

川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中绵羊的PRLR基因序列设计引物,以川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊垂体总RNA为模板,通过RT-PCR技术对川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及进行序列分析,以期为进一步研究该基因与山羊的繁殖性能奠定理论基础.结果表明:川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区均长1746bp,均编码581个氨基酸.川中黑山羊(金堂类群)PRLR基因编码区与藏山羊、绵羊、牛、牦牛野猪和人的同源性分别为99.71%、99%、95%、95%、83%和80%.以核苷酸序列构建分子系统进化树,川中黑山羊(金堂类群)先与藏山羊聚为一类,再与绵羊聚为一类,后与牛和牦牛聚为一类,然后与野猪聚为一类,最后与人聚为一类.     

牦牛雌激素受体ERα和ERβ基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异.根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布.结果表明,分别获得2 100 bp ERα(Gen Ban K登录号:KJ011123)和1 791 bp ERβ(Gen Ban K登录号:KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸.多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5%和53.9%-99.1%.荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ.此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低.而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之,心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低.为进一步了解牦牛ERα和ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础.     

牦牛黑素皮质素受体-4基因的克隆与序列分析

对牦牛黑素皮质素受体-4（MC4R）基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展牦牛MC4R基因与其肥胖性状的相关分析以及基因定位、表达调控等研究提供理论基础。首先采用特定引物对牦牛MC4R基因进行PCR扩增、克隆和测序,然后用B ioEd it7.0.0软件拼接MC4R基因全序列,用DNAMAN5.2.2软件对编码序列进行翻译,用DNAStar6.13比对后比较基因和氨基酸序列同源性。实验获得牦牛MC4R基因全长1343bp,其中编码序列全长999bp,共编码332个氨基酸残基的蛋白质。牦牛MC4R基因序列与普通牛、人、食蟹猴、猪、狗、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼、金鱼、东方鲀和河豚的同源性分别是99.5%、85.5%、84.9%、88.1%、86.7%、83.9%、83.8%、75.5%、61.2%、59.5%、65.3%和64.6%,由此推导的氨基酸序列同源性分别是99.1%、91.9%、91.9%、93.1%、92.2%、90.4%、89.8%、84.0%、66.7%、65.7%、67.2%和66.7%。本研究成功的克隆了牦牛的MC4R基因,表明其在物种间具有较高的保守性。     

蒙古鮊ob基因的克隆与组织表达特异性的初步研究

根据已知的人和鼠ob基因序列设计引物,通过运用RT-PCR技术首次从蒙古鮊脂肪组织的RNA中扩增获得ob基因片段,并经序列分析证实为ob基因编码区438 bp的序列.不同物种同源性比较表明ob基因序列具有很高的保守性:蒙古鮊与人、猪和鼠的ob基因核苷酸编码序列的同源性分别为82.9%、84.0%和99.1%;蒙古鮊ob基因编码的蛋白leptin氨基酸序列与人、猪和鼠氨基酸同源性分别为80.8%、78.8%和95.9%.用RT-PCR技术分析组织ob基因的表达特异性,结果表明:ob基因在脂肪和肝脏组织中的表达量最大,在心脏、脾脏、肌肉、脑、卵巢中的表达量次之,在肾脏中仅微量表达,而在精巢和肠道组织中则不表达.     

草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从草鱼肌肉组织中克隆出MSTN cDNA序列,长度为1764 bp,编码区为1128 bp,共编码375个氨基酸.前体蛋白包括信号肽序列、N端前肽区、蛋白酶水解位点RIRR及C端活性区(含9个保守的Cys残基).多重序列比较表明,草鱼与斑马鱼、黑头软口鲦之间的MSTN序列同源性在94%以上,与其它鱼类之间的序列同源性也较高(78.1%~82.3%),但与鸟类、哺乳类之间的序列同源性则相对较低.系统进化分析显示,不同物种间的MSTN序列同源性基本反映了它们的亲缘关系.     

牦牛α-乳清蛋白基因5''''-非翻译区部分序列测定及PCR-RFLP分析

用PCR方法扩增了麦洼牦牛α-乳清蛋白基因5'-非翻译区的部分序列.该序列与普通牛的相应序列具有很高的同源性(98.1%),但存在8个碱基差异,碱基突变类型包括1个缺失,5个转换和2个颠换.应用PCR-RFLP方法分析了麦洼牦牛和九龙牦牛α-乳清蛋白基因-1689位单碱基的多态性,结果在该位点没有检测到多态性.     

牦牛催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析

扩增出牦牛催乳素受体（尸碰尺）基因部分保守序列,为研究牦牛乳腺组织中朋三尺基因表达水平奠定基础．提取牦牛乳腺组织总RNA,根据NCB1的奶牛Jp月￡只基因cDNA序列的保守区设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增牦牛尸胜尺基N,结果获得577bp的片段,将该片段连接于pMD18-Simple质粒中,转化大肠杆菌,菌液PCR鉴定阳性克隆子,测序并分析氨基酸序列．分析序列与氨基酸与其他物种同源性,结果表明该序列与水牛、奶牛、绵羊、人、小鼠的尸RLR基因mRNA的对应序列的同源性分别为97．40％、99．13％、93．41％、71．07％、60．20％,编码的氨基酸同源性分别为97．40％、100％、95．83％、82-38％、72-22％．     

猪SOSC5和SOCS6基因克隆及组织表达研究

本文以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆得到长白猪细胞因子抑制因子SOCS-5基因和长白猪SOCS-6基因.序列分析结果显示:长白猪SOCS-5基因cDNA全长1688 bp,编码一个含有536个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为97％、97％、94％和95％;SOCS-6基因cDNA全长1645 bp,编码一个含有535个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为:92％,97％,85％,82％.氨基酸结构分析显示,长白猪SOCS-5和SOCS-6基因都具有典型的中央SH2结构域和C末端有40个氨基酸的SOCS Box结构域;组织表达图谱分析结果显示:长白猪SOCS5基因在大脑、心脏、脾脏、肌肉组织大量表达,在下丘脑、肝脏、肾脏、小肠中也有表达;SOCS6基因在大脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉及小肠均大量表达.此外,本研究还将SOCS-5和SOCS-6基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

牛ANGPTL1基因的电子克隆与序列分析

以牛的ANGPTL1基因为研究对象,利用生物信息学方法,对牛的ANGPTL1基因进行了电子克隆和序列分析,并对推导出的ANGPTL1蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛的ANGPTL1基因序列长为2576bp,该基因的编码序列长为1476bp,编码492个氨基酸,编码序列的两翼有135bp的5’非编码区和785bp的3’非编码区。DNA序列的G＋C百分含量为44．31％,A＋T百分含量为55．69％。该基因的核苷酸序列与人、黑猩猩、鼠和狗ANGPTL1基因的cDNA序列的相似性分别为91％、90％、82％和93％。在氨基酸序列上与人、黑猩猩、鼠和狗的相似性分别为95％、95％、92％和95％。用氨基酸序列构建的进化树显示,在人、牛、黑猩猩、狗、褐鼠、原鸡几种动物中,牛与狗的亲缘关系最近。     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从草鱼肌肉组织中克隆出MSTN cDNA序列,长度为1764 bp,编码区为1128 bp,共编码375个氨基酸.前体蛋白包括信号肽序列、N端前肽区、蛋白酶水解位点RIRR及C端活性区（含9个保守的Cys残基）.多重序列比较表明,草鱼与斑马鱼、黑头软口鲦之间的MSTN序列同源性在94%以上,与其它...     

牦牛雌激素受体ERα和 ERβ 基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异。根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布。结果表明,分别获得2 100 bp ERα(GenBanK登录号：KJ011123)和1 791 bp ERβ(GenBanK登录号：KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸。多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5% 和 53.9%-99.1%。荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ。此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低。而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之, 心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低。本研究为进一步了解牦牛ERα 和 ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础。