双抗体夹心ELISA检测禽流感病毒方法的初步建立

用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒(AIV)抗原的双抗体夹心ELISA方法. 经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件为:兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1: 8 000(浓度为3.531 ug/mL),抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1: 800,酶标二抗的工作浓度为1: 4 000. 与其他禽易感病毒(NDV、IBV、EDS-76V)等均没有交叉反应. 结果表明,本方法具有很高的特异性.     

猪离体软组织超声频谱衰减特性实验分析

应用频谱分析的谱差法,对猪离体的脂肪、肌肉及肝组织的超声传输衰减特性进行了实验分析.结果表明,猪脂肪、肌肉组织的衰减系数随频率的变化与指数规律符合相当好;肝组织的衰减乐数和频率的关系与线性规律接近.     

兔抗人M-CSF特异性抗体在夹心ELISA方法检测人M-CSF中的应用

用人尿来源经纯化的 M-CSF 免疫家兔制备抗 M-CSF 物异性抗体.经 ELISA试验证明该抗体可对天然和重组人 M-CSF 进行特异性识别,与人的 GM-CSF 和 IL-3无交叉反应,并且该抗体可中和天然人 M-CSF 集落刺激活性。用该抗体与人 M-CSF 标准品进行夹心 ELISA 实验,结果证明夹心 ELISA 方法测定的标准品 M-CSF 含量与实际相一致,并且与软琼脂骨髓细胞集落形成试验检测到的活性结果相平行。     

鳗鲡源创伤弧菌的间接ELISA快速检测

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)血清2型对鳗鲡有专一的感染性,是鳗鲡出血性败血症、烂鳃病和烂尾病的重要病原菌。采用间接ELISA法对制备的兔抗创伤弧菌多克隆抗血清进行效价测定,结果表明其效价高达1∶512 000。从发病鳗鲡中分离出创伤弧菌和37株其他致病菌,将38株病原菌以较低浓度(1×106cfu/m L)包被后通过兔抗创伤弧菌血清进行交叉反应水平检测,结果表明,兔抗创伤弧菌血清稀释到1∶256 000或1∶128 000时,其与37株其他病原菌均未产生明显的ELISA交叉反应。该血清分别经1∶64 000和1∶32 000稀释后,采用ELISA方法检测了经创伤弧菌、鳗鲡爱德华氏菌(Edwardsiella anguillarum)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒感染死亡的美洲鳗鲡(Auguilla rostrata)脏器组织悬液(肝脏、肾脏和鳃),结果表明,兔抗创伤弧菌血清经1∶32 000稀释后可特异性检出鳗鲡鳃和肾脏组织中的创伤弧菌。     

大蹼铃蟾皮肤白蛋白的分离纯化及抗体制备

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,在大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤中得到其白蛋白(BmA-skin).该蛋白具有较强的胰蛋白酶抑制活性.用0.5mg/只BmA-skin作为免疫源免疫大白兔,经三次免疫后,抽取大白兔血液,分离血清,饱和硫酸氨沉淀,获得抗BmA-skin的多克隆抗体.经ELISA方法测定该抗体与大蹼铃蟾白蛋白发生免疫反应,抗体滴度为1:100000.     

猪圆环病毒Ⅱ型抗体检测ELISA试剂盒的制备

猪圆环病毒(PCV)两个血清型中只有PCV2为致病性病毒.将ORF2蛋白作为抗原建立区别两型PCV的血清学检测方法.去除N端信号肽的ORF2片段在大肠杆菌中BL21(DE3)中进行了表达.SDS-PAGE凝胶电泳表明在26 k D处有一个明显的表达条带,并且可以和猪圆环病毒阳性血清发生反应,表明重组蛋白表达成功.以表达的ORF2蛋白作为包被原,建立了检测猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法.与商品化试剂盒同时检验78份临床血清,符合率为95%;同时与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒均无交叉反应.     

左氧氟沙星人工抗原的制备及其抗体鉴定

用N-羟基琥珀酰亚胺法把左氧氟沙星与载体蛋白牛血清白蛋白偶联制备免疫抗原,用氯甲酸异丁酯法将左氧氟沙星与鸡卵清蛋白偶联,制备包被检测抗原,采用紫外扫描法对合成的抗原进行鉴定.用免疫抗原免疫大白兔获得抗左氧氟沙星多克隆抗体血清,经间接ELISA试验检测特异性抗体效价,测得效价达1:212以上.通过紫外扫描及间接ELISA试验,结果表明,制备的抗原和抗体获得成功.     

抗人PD-1高亲和力抗血清的制备及其在PD-1免疫印迹分析中的应用

利用纯化的可溶性人PD-1胞外域(sPD-1)蛋白为免疫原免疫小鼠,获得抗血清.免疫印迹显示该抗血清与原核表达的sPD-1有特异性反应,但与某些菌体蛋白存在交叉反应.经菌体蛋白吸附法处理后,交叉反应明显减弱.以商业化抗人PD-1抗体和小鼠sPD-1抗血清分析经亲和层析富集的活化的Jurkat T细胞表达的PD-1,只有自制的抗血清鉴定到特异反应条带,其表观分子质量为49 ku.     

免疫PCR方法检测乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体

目的为乳腺癌诊断提供血清学新方法.方法免疫PCR方法检测血清抗p53蛋白抗体,酶免疫组化方法检测组织p53蛋白表达.结果乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体阳性率为39.5%,而非癌患者和正常人血清抗p53蛋白抗体均为阴性,乳腺癌患者血清中抗p53蛋白抗体显著高于非癌患者和正常人(P＜0.01).p53蛋白阳性表达的乳腺癌患者抗p53蛋白抗体阳性率为64.2%,明显高于p53蛋白阴性表达组,血清p53抗体测定与p53蛋白表达密切相关(P＜0.01).结论检测血清抗p53蛋白抗体是检测组织p53蛋白理想的替代工具抗p53蛋白抗体可以作为乳腺癌血清学诊断新标志,用于乳腺癌的普查和早期诊断.     

IB-ELISA诊断试剂的研究

目的　为鸡群日常监测传染性支气管炎病毒 (IBV)抗体提供一个方便、特异、快速的检测方法。方法　利用 9日龄SPF鸡胚尿囊腔接种培养IBV ,以及鸡胚成纤维细胞传代培养IBV ,经纯化后 ,测定蛋白含量 ,作为包被抗原 ,利用过碘酸盐法标记兔抗鸡IgG作为酶结合物 ,用TMB作为显色剂 ,建立起酶联免疫吸附试验 (ELISA)技术 ,检测血清样品中传染性支气管炎抗体。结果　上述两种方法制备的抗原皆可用于此试验 ,与NDV、MDV、IBDV、AIV、APIV、REV、ILTV、IC、MG、MS等抗血清无交叉反应 ,与IDEXXIB ELISA比较 ,结果吻合较好。结论　本研究制备的IB ELISA诊断试剂 ,可用于日常监测传染性支气管炎病毒抗体     

改良碱变性法抽提冷冻山羊肝脏组织线粒体DNA

通过实验建立了一种简便、快捷地从冷冻山羊肝脏组织中制备高质量线粒体DNA（mtDNA）的方法.以差速离心法分离线粒体，用碱性SDS法裂解线粒体膜，释放线粒体DNA后用酚／氯仿抽提.与其他方法相比较，该方法具有对组织新鲜度要求不高，快速、简便、经济、产品产量高以及稳定性好等特点，其得率和纯度均能满足mtDNA多样性分析的要求.     

Molecular cloning and characterization of an insulin-regulatable glucose transporter

A major mechanism by which insulin stimulates glucose transport in muscle and fat is the translocation of glucose transporters from an intracellular membrane pool to the cell surface. The existence of a distinct insulin-regulatable glucose transporter was suggested by the poor cross-reactivity between antibodies specific for either the HepG2 or rat brain glucose transporters and the rat adipocyte glucose transporter. More direct evidence was provided by the production of a monoclonal antibody (mAb 1F8) specific for the rat adipocyte glucose transporter that immunolabels a species of relative molecular mass 43,000 (43K) present only in tissues that exhibit insulin-dependent glucose transport, suggesting that this protein may be encoded by a different gene from the previously described mammalian glucose transporters. This antibody has been used to immunoprecipitate a 43K protein that was photoaffinity-labelled with cytochalasin B in a glucose displaceable way, and to immunolabel a protein in the plasma membrane of rat adipocytes, whose concentration was increased at least fivefold after cellular insulin exposure. Here we describe the cloning and sequencing of cDNAs isolated from both rat adipocyte and heart libraries that encode a protein recognized by mAb 1F8, and which has 65% sequence identity to the human HepG2 glucose transporter. This cDNA hybridizes to an mRNA present only in skeletal muscle, heart and adipose tissue. Our data indicate that this cDNA encodes a membrane protein with the characteristics of the translocatable glucose transporter expressed in insulin-responsive tissues.     

基于双向电泳技术的丙酮丁醇梭菌ATCC824不同产物阶段膜蛋白质组比较

建立丙酮丁醇梭菌在产酸阶段和产有机溶剂阶段的膜蛋白质组;并进行比较分析。研究采用差速离心法提取了该菌在产酸阶段和产有机溶剂阶段的膜蛋白,进行双向电泳分离后,对差异蛋白进行质谱分析。不同生长阶段膜蛋白质组存在明显差异,经质谱鉴定发现9个差异蛋白质,其中3个在产酸阶段高表达,6个在产有机溶剂阶段高表达。生物信息学分析表明,大部分蛋白含有明确的膜定位信息。产酸阶段高表达蛋白多与细胞信号转导有关,而产有机溶剂阶段高表达蛋白功能分布相对复杂。丙酮丁醇梭菌在不同产物阶段的差异膜蛋白被成功鉴定,它们可能在不同产物阶段的转换和细胞信号转导等过程中起到重要调控作用。     

双抗原夹心ELISA检测抗鳗弧菌抗体效价的研究

建立检测抗鳗孤菌抗体效价的双抗原夹心ELISA法,评价其可行性。采用高碘酸盐法对鳗孤菌抗原进行辣根过氧化物酶标记,并通过血清抗体效价比较双抗原夹心ELISA与微量凝集法的优越性。结果显示：标记蛋白含量为2．5mg的抗原所需HRP的最适量为0．20rag。以超声破碎后鳗弧菌离心上清为最适标记抗原,其工作浓度为12．25mg／L．并且双抗原夹心ELISA操作简易具有较高的敏感性和特异性。     

两相分配法制备甘草根质膜及其纯度鉴定

以甘草（Glycyrrhiza uralensis F．）根为材料,利用差速离心法获取细胞微粒体,通过水溶性聚合物Dextran T-500和PEG4000所构成的两相分配体系制备质膜．标志酶鉴定结果表明,上相中富含质膜,内膜污染较少,质膜纯度较高;下相中富含其它内膜．Western blot分析结果表明,在对应于水通道蛋白分子量大小的位置存在特异条带．实验证明,PEG-Dextran两相分配体系可获得较高纯度的甘草根密实正向型质膜囊泡．     

An H+-ATPase in opposite plasma membrane domains in kidney epithelial cell subpopulations

Vectorial solute transport by epithelia requires the polarized insertion of transport proteins into apical or basolateral plasmalemmal domains. In the specialized intercalated cells of the kidney collecting duct, the selective placement of an apical plasma membrane proton-pumping ATPase (H+-ATPase) and of a basolateral membrane anion-exchange protein results in transepithelial proton secretion. It is currently believed that amino-acid sequences of membrane proteins contain critical signalling regions involved in sorting these proteins to specific membrane domains. Recently, it was proposed that intercalated cells can reverse their direction of proton secretion under different acid-base conditions by redirecting proton pumps from apical to basolateral membranes, and anion exchangers from basolateral to apical membranes. But others have found that antibodies raised against the red cell anion-exchange protein (Band 3) only labelled intercalated cells at the basolateral plasma membrane, providing evidence against the model of polarity reversal. In this report, we have examined directly the distribution of proton pumps in kidney intercalated cells using specific polyclonal antibodies against subunits of a bovine kidney medullary H+-ATPase. We find that some cortical collecting duct intercalated cells have apical plasma membrane proton pumps, whereas others have basolateral pumps. This is the first direct demonstration of neighbouring epithelial cells maintaining opposite polarities of a transport protein. Thus, either subtle structural differences exist between proton pumps located at opposite poles of the cell, or factors other than protein sequence determine the polarity of H+-ATPase insertion.     

抗三尖杉酯碱的HL60细胞蛋白质磷酸化

研究了抗三尖杉酯碱的ＨＬ６０细胞蛋白质磷酸化的变化。经差速离心得到纯膜蛋白，抗性细胞有一高度磷酸化的１１０ｋｕ的蛋白质存在，免疫沉淀ｃ－ＫＡＦ－１蛋白激酶，抗性细胞内ｃ－ＲＡＦ－１蛋白激酶磷酸化程度明显提高，其活性被蛋白激酶Ｃ抑制剂ＣａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ明显地抑制。结果表明：ＨＬ６０细胞对三尖杉酯碱的抗药性与蛋白质高度磷酸化有关；抗性细胞内ｃ－ＲＡＦ－１蛋白激酶磷酸化程度明显提高，可能与多药抗药性和抗细胞调亡有关。     

Ca2+、CaM及CaM拮抗剂对粟酒裂殖酵母质膜H+-ATP酶活性的影响

经差速离心,酸处理,蔗糖密度梯度离心制备粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）质膜H^＋-ATP酶,以研究Ca^2＋、CaM以及CaM拮抗剂对纯化的质膜H＋-ATP酶活性的影响.结果表明Ca^2＋强烈的抑制该酶的活性,而CaM对该酶的活性没有影响,但TFP与Compound R24571这两类CaM拮抗剂又都能强烈地抑制该酶的活性.推测TEP等抑制该酶的活性不是通过与CaM结合作为CaM的拮抗剂竞争性抑制该酶的活性,而是直接对该酶发生作用或者通过磷脂或其它的CaM依赖性的膜蛋白间接对该酶产生作用.     

牛乳清蛋白BALB/c小鼠过敏模型的建立及其优化

目的:建立牛乳清蛋白的BALB/c小鼠过敏模型,并探讨不同佐剂、免疫途径及饲料纯度等因素对建立牛乳清蛋白的BALB/c小鼠过敏模型的影响。方法:用不含牛乳及乳制品的特制饲料饲养BALB/c小鼠以乳清蛋白致敏,间接ELISA法测定特异性IgE,用荧光法检测体外激发小鼠致敏肥大细胞释放的组胺。结果:成功建立BALB/c小鼠乳清蛋白过敏模型,条件优化结果显示,氢氧化铝佐剂结合皮下注射最好地促进特异性IgE产生;用不含牛奶及其他食物过敏原的特制饲料饲养的小鼠特异性IgE的本底水平低,适于建立小鼠过敏模型,荧光法检测肥大细胞释放组胺的结果与特异性IgE检测结果一致。结论:用特制饲料饲养小鼠,氢氧化铝佐剂结合皮下注射乳清蛋白适于建立BALB/c小鼠过敏症模型,该模型可用于过敏症机理研究。     

糯谷猪解耦联蛋白3和心脏型脂肪酸结合蛋白在骨骼肌中的表达和定位

 为了探索解耦联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）和心脏型脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid binding protein,H FABP）对骨骼肌细胞中脂肪代谢的调节作用,采用RT PCR和免疫组织化学方法,研究了地方猪品种糯谷猪骨骼肌细胞中UCP3和H FABP基因的表达和细胞内定位,并与外二元杂交猪相比较,结果表明,糯骨猪的肌细胞及其细胞间隙较大,血清游离脂肪酸和肌内脂肪含量较高; 但UCP3和H FABP基因表达量和蛋白分布密度均较杂交猪低。说明糯谷猪肌细胞中UCP3和H FABP的表达量较少,肌细胞中ATP的生成效率较高,对脂肪酸供能的依赖性较低,脂肪得以贮存。提示UCP3和H FABP主要以蛋白量的变化参与猪骨骼肌细胞的脂肪代谢调节,从而影响地方猪种的肉质等性状。